में सूक्ष्म चैनलों द्वारा विशिष्ट केशिका क्रिया अस्थि-तरह टेम्पलेट्स बड़े बोनी दोष की बहाली के लिए कक्षों की भर्ती को बढ़ा सकते हैं
Summary
A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.
Abstract
अच्छी तरह से वितरित और स्थिरतापूर्वक डाला टेम्पलेट के लिए लंगर डाले है कि एक सक्रिय, संपन्न सेल की आबादी के बिना, असाधारण हड्डी उत्थान नहीं होती है। पारंपरिक टेम्पलेट्स के साथ, गहरे टेम्पलेट्स के अंदर सेल घुसपैठ, वितरण, और निवास के अभाव में आंतरिक सूक्ष्म चैनलों परिणामों के अभाव। इसलिए, सूक्ष्म चैनल के साथ एक बेहद असुरक्षित और समान रूप से परस्पर घरनदार की हड्डी की तरह टेम्पलेट (biogenic microenvironment टेम्पलेट, बीएमटी) इन बाधाओं को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया है। उपन्यास बीएमटी नवीन अवधारणाओं (केशिका क्रिया) द्वारा बनाई गई और एक स्पंज-टेम्पलेट कोटिंग तकनीक के साथ निर्मित किया गया था। आपस में जुड़े प्राथमिक-pores (300-400 माइक्रोन) पर घरनदार हड्डी में pores, प्रत्येक trabecula भीतर सूक्ष्म चैनल (25-70 माइक्रोन), और nanopores (100-400 एनएम) है कि नकल: बीएमटी कई संरचनात्मक घटक होते हैं कोशिकाओं लंगर के लिए अनुमति देने के लिए सतह। इसके अलावा, बीएमटी सिम के लिए यांत्रिक परीक्षण अध्ययन से प्रलेखित किया गया हैमानव घरनदार हड्डी (~ 3.8 एमपीए) 12 में से उन लोगों के लिए ilar यांत्रिक शक्ति गुण।
बीएमटी पुल के आकार का (Π) टेम्पलेट्स (3 सेमी ऊंचाई और 4 सेमी लंबाई) में उच्च अवशोषण, प्रतिधारण, और कोशिकाओं की बस्ती का प्रदर्शन किया। शुरू में थे कि कोशिकाओं तुरंत सेल मीडिया पर बीएमटी की केशिका क्रिया से दूसरे छोर (10 सेमी की दूरी) के लिए जुटाए टेम्पलेट्स के एक छोर में वरीयता प्राप्त। 4 घंटे के बाद, कोशिकाओं homogenously पूरे बीएमटी पर कब्जा कर लिया और सामान्य सेलुलर व्यवहार का प्रदर्शन किया। केशिका क्रिया मीडिया और बीएमटी भर में वितरण (सक्रिय माइग्रेशन) में निलंबित कोशिकाओं की घुसपैठ के लिए जिम्मेदार है। बीएमटी की इन क्षमताओं मनाया करने के बाद हम BMTs शारीरिक शर्तों के तहत परिधि से अस्थि मज्जा कोशिकाओं, वृद्धि कारक है, और पोषक तत्वों को अवशोषित करेंगे कि परियोजना।
बीएमटी तेजी से घुसपैठ, समरूप वितरण और inhabita के माध्यम से वर्तमान सीमाओं को हल कर सकते हैंबड़े, बड़ा टेम्पलेट्स में कोशिकाओं की nce भारी कंकाल दोष मरम्मत के लिए।
Introduction
The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5.
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration.
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few µm to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.
Protocol
Representative Results
Discussion
आदि कोशिकाओं, वृद्धि कारक है, पोषक तत्वों, सहित एक बहु घटक टेम्पलेट सफल हड्डी उत्थान और महत्वपूर्ण आकार बड़े अस्थि दोष के कार्यात्मक बहाली के लिए आवश्यक है। इन कारकों के भीतर, संरचनात्मक अनुरूप जैविक गुणों आवश्यक हैं। जैविक कार्यक्षमता को पूरा करने के लिए, टेम्पलेट biocompatibility, osteoconductivity, यांत्रिक अखंडता, पर्याप्त सतह क्षेत्र, पर्याप्त सतह बनावट, और ऑक्सीजन और पोषक तत्व परिवहन के लिए इसका मतलब प्रदर्शन करना चाहिए। मदद की पैठ टेम्पलेट में (सक्रिय भर्ती), टेम्पलेट (प्रतिधारण) भर में एक समान वितरण, त्वरित प्रसार और उच्च व्यवहार्यता (बस्ती): सेलुलर स्तर पर, निम्नलिखित विशेषताएं भारी अस्थि दोष के कार्यात्मक बहाली के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। अंत में, पर्याप्त अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स के बाद के गठन और जीन अभिव्यक्ति के ट्रिगर ऐसे तेजी vascularization एक के रूप में आवश्यक जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैंएन डी अस्थिजनन।
सिंथेटिक विकल्प के कई अलग अलग प्रकार के ऑटो / allo- हड्डी ग्राफ्ट को बदलने के लिए प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, मौजूदा पाड़ संगठन सूक्ष्म चैनलों और नैनो के pores युक्त एक आंतरिक microenvironment प्रदर्शन नहीं करता है, और इसलिए सक्रिय रूप से गहरी 10 मिमी से बड़े होते हैं कि सिंथेटिक के विकल्प में सेल घुसपैठ, वितरण, और निवास की सुविधा नहीं है। वे कुशलता से, तेजी से, और समान रूप से अस्थि टेम्पलेट में गहराई से विस्थापित करने के लिए कोशिकाओं अग्रणी के लिए शारीरिक संकेतों प्रदान नहीं करते हैं। इसके बजाय, कोशिकाओं की सीमित निष्क्रिय भर्ती पाड़ की बाहरी और भीतरी क्षेत्रों के बीच एक असमान वितरित सेल आबादी बनाता है। इस टेम्पलेट के भीतरी कोर तक पहुँचने कोशिकाओं की प्रारंभिक चुनौती exacerbates लेकिन यह भी सिंथेटिक विकल्प के दूसरे छोर के साथ पोषक तत्व प्रवाह और सेल संचार में अवरोध उत्पन्न होता ही नहीं। सेल डी में disproportional सेल भर्ती और डेरा परिणाम इस प्रकार कापाड़ के बाद Eath और अधूरा हड्डी विकास शरीर 14,15 में प्रत्यारोपित कर दिया गया है।
इस प्रकार, हम इन बाधाओं को संबोधित करने के लिए प्राथमिक शारीरिक क्यू के रूप में केशिका कार्रवाई की अवधारणा को पेश किया है। हम अच्छी तरह से सक्रिय रूप से बीएमटी में गहरी कोशिकाओं की भर्ती के लिए जिम्मेदारी से प्राथमिक खींच बल के लिए खाते में जाएगा कि केशिका क्रिया के लिए प्रेरित करने बीएमटी में सूक्ष्म चैनलों इंजीनियर है।
पु स्पंज कोटिंग तकनीक कई अद्वितीय गुण प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, यह खुद को पूर्व निर्धारित टेम्पलेट ढांचे पर निर्भर है, जो अच्छी तरह से नियंत्रित झरझरा घरनदार संरचनाओं का एक आसान तैयारी के लिए अनुमति देता है (यानी, 300-400 माइक्रोन के लिए इंच टेम्पलेट प्रति 80 ताकना)। इस अस्थिकोरक घुसपैठ 15 के लिए छेद के आकार के अनुकूलन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। दूसरा, तकनीक सेल स्थानांतरण 11 प्रारंभ कर की महत्वपूर्ण भूमिका के लिए खाते में जो परस्पर सूक्ष्म चैनलों के निर्माण में सक्षम बनाता है। कस्टम आकार और टेम्पलेट्स के आकार बनाने के मामले में पु स्पंज का उपयोग करते समय तीसरा, लगभग कोई सीमाएं हैं। निर्माता साधारण आकार या जटिल geometries के लिए भी गणना लेजर काटने के लिए एक कैंची का उपयोग कर सकते हैं। इन ठीक नियंत्रित प्रौद्योगिकियों का उपयोग करना, हम बीएमटी बनाया। हा, क्योंकि इसकी biocompatibility और osteoconductive क्षमता 17 से शुरू होने वाले माल के रूप में चयनित किया गया था।
इस अध्ययन में, पर प्रकाश डाला जा करने की जरूरत है कि कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। तापमान बहुत अधिक है और सरगर्मी गति बहुत कम है यदि हा घोल तैयार करने के दौरान, हा घोल बीकर के नीचे किनारों पर अटक हो जाते हैं और सूख जाएगा। अतिरिक्त हा घोल बाहर बह जब कोटिंग की प्रक्रिया के बाद, एक हवा के दबाव का भी उच्च बीएमटी की सतह पर दरारें पैदा कर सकते हैं। यह ठीक से अतिरिक्त हा घोल केवल बाहर हवा अपेक्षाकृत कम हवा के दबाव रखने के लिए महत्वपूर्ण है। Sintering प्रक्रिया के अंत में, दूसरे और तीसरे कदमसबसे महत्वपूर्ण (हीट 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट 280 डिग्री सेल्सियस और गर्मी 0.5 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक 400 डिग्री सेल्सियस तक) कर रहे हैं। हा घना हो जाता है, जबकि इस तापमान रेंज में, पु स्पंज पूरी तरह से बाहर जला देगा। इस प्रोटोकॉल बारीकी से पीछा नहीं कर रहा है, बीएमटी ढह या sintering के बाद टूटने लगे किया जाएगा।
इस अध्ययन में वर्णित बीएमटी कई लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले,-इंटर जुड़ा स्थूल pores (300-400 माइक्रोन) मानव घरनदार हड्डी के उन नकल और चिकनी अस्थि मज्जा प्रवाह के लिए अनुमति देता है। दूसरा, टेम्पलेट्स केशिका क्रिया के माध्यम से अस्थि कोशिकाओं की प्रारंभिक प्रवेश में तेजी लाने के लिए प्रत्येक घरनदार पट भीतर सूक्ष्म चैनल (25-50 माइक्रोन) के शामिल हैं। टेम्पलेट केवल 300 माइक्रोन pores (प्राथमिक pores) और कोई microchannels था, कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन 13 का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया, केशिका क्रिया अस्थि मज्जा के साथ टेम्पलेट का पूरा संतृप्ति के लिए अपर्याप्त होगा। यह विशेष रूप से एल की आवश्यकता होगी कि बड़े आकार के दोष के लिए सच का आयोजन होगाARGE आकार टेम्पलेट्स। माइक्रोमीटर आकार चैनलों प्रदर्शनी अत्यधिक प्रभावी तरल पदार्थ अवशोषण, और इस तरह हम सूक्ष्म चैनलों हमारे अध्ययन में केशिका कार्रवाई के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार होने की उम्मीद। तीसरा, हमारे BMTs रणनीतिक नैनो pores को रखा है। साहित्य से डेटा कोशिकाओं नैनो पैटर्न 18,19 करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हैं कि संकेत मिलता है; इसलिए, हम सेल लगाव बढ़ाने में एक भूमिका निभाने के लिए सूक्ष्म चैनलों की दीवारों पर नैनो के pores की उम्मीद है। घरनदार सेप्टा की सतह पर नैनो आकार pores (100-400 एनएम) लंगर के लिए कोशिकाओं स्थिर अनुमति। कुल मिलाकर, इन तीन आंतरिक संरचनाओं के संयुक्त प्रभाव टेम्पलेट भर बढ़ाया सेल जुटाना और आसंजन में हुई। हालांकि, प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं और सही बीएमटी निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। उदाहरण के लिए, कोटिंग, जबकि एक सजातीय चिपचिपापन रखने की कठिनाई के कारण तैयार हा घोल की एक बड़ी राशि वहाँ अक्सर है। इसके अलावा बनाने में एक सीमा हैकारण कोटिंग, जबकि समय काम करने के लिए खंड में 5 सेमी 3 से अधिक टेम्पलेट्स। कोटिंग मोटाई निर्माता तकनीक पर निर्भर करता है, जो महत्वपूर्ण है।
हमारे अध्ययन के निष्कर्ष बताते हैं कि अवशोषित और पारंपरिक alloplastic (या सिंथेटिक) मचानों से अधिक संभावित लाभ की पेशकश करेगा कोशिकाओं को बनाए रखने में सक्षम बीएमटी। एक भावी अध्ययन हड्डी से संबंधित विकास कारकों के साथ अस्थिजनन और / या एंजियोजिनेसिस पर बीएमटी के लाभों को सत्यापित करने के लिए विचार किया जा रहा है। इसलिए, हम अपने अद्वितीय विशेषताओं बीएमटी पाड़ बड़े दोष में सिंथेटिक निर्माणों और अधूरा हड्डी उत्थान में अपर्याप्त अस्थि मज्जा घुसपैठ की प्रमुख बाधाओं को संबोधित कर सकते हैं कि दावा करते हैं।
इस अध्ययन का अंतिम लक्ष्य समय / श्रम प्रधान अस्थि मज्जा स्ट्रोमा के लिए आवश्यकता को नष्ट करने से महत्वपूर्ण आकार बोनी दोष में हड्डी पुनर्निर्माण और कार्यात्मक बहाली में bioengineering के वर्तमान प्रतिमान को आसान बनाने के लिए हैएल कोशिकाओं अलगाव और विस्तार प्रक्रियाओं। अंत में, हम हड्डी के पुनर्निर्माण के लिए तेजी से सेल अवशोषण, समरूप वितरण, और निवास के लिए प्रेरित जो सूक्ष्म चैनलों और नैनो pores, के साथ 3 डी-निर्माणों अनुरूप संरचनात्मक रूप से उपयोग करने का लक्ष्य है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| polyurethan sponge | Plastifoam | PU-3215 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 167176 | |
| Hydroxyapatite Powder | Ossgen | ||
| Polyvinyl Alcoho | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| Carboxymethyl cellulose sodium salt | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| ammonium polyacrylate | Vanderbilt | DARVAN 821A | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G2289 |
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