Planar Gradient Diffusion System til Undersøg Chemotaxis i en 3D kollaqenmatrix

Summary

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Abstract

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Introduction

Den foretrukne bevægelse af celler mod en koncentrationsgradient, kendt som kemotaksi, spiller en vigtig rolle i patologiske og fysiologiske processer i kroppen. Sådanne eksempler er hud og slimhinder sårheling ^1, morfogenese ^2, inflammation ^3, og tumorvækst ^4,5. Det har også vist sig, at kræftceller kan migrere gennem både individuelle og kollektive strategier celle migrering ^6. Desuden kan diffusionssystemer ustabilitet mekanismer fremkalde adskillelse af enkelte eller grupperede celler fra en tumorform krop / objekt og derefter kan indvandre i retning af en kilde til næringsstoffer og dermed invadere bredere områder og væv ^7.

Desuden har det vist sig, at forskellige mekanismer migration kan være aktiv i 2D og i 3D, på grund af forskellige roller adhæsionsmolekyler ^8. Derfor, for at et skifte til fysiologisk relevant i vitro assays undersøge celle motilitet i en measureable og enkel måde, er af betydning for forståelsen cellebevægelse fænomener ^9. Desværre det er vanskeligt at analysere celle migration, en omfattende kvantificerbar kemotaksi assay kræver som regel en lang besværlig metode, der bygger på måling af upartiske cellemotilitet og transport fænomener modellerne.

Tidligere eksperimentelle metoder til at undersøge celle kemotaksis omfatter Boyden kammer ¹⁰ og under agarose assay ^11. Men inden for disse tidlige assays, cell migrationseksperimenter ikke overvåge bevægelse i forhold til tiden. Mere, vigtigere, koncentrationsgradienter anvendt til forsøgene var ikke veldefineret eller helt forstået mens kun opretholde signaleringen for ikke mere end nogle få timer. Desuden tidlig kemotaksis kammer forsøg begrænset celle migration til to dimensioner og ikke tillader en at overvåge kinetik migration ^12. Ser man på Boyden kammer, en endpoint assayville ikke tillade forskeren at observere migration visuelt og kunne ikke direkte skelne kemotaksi (retningsbestemt bevægelse) fra kemokinese (tilfældig bevægelse). Derudover flere variable-forskelle i porestørrelsen og tykkelsen af membraner fremstillet kammeret meget vanskeligt at reproducere og let skjult den vandrende reaktion af celler til chemokiner ^13,14.

Med den nye forståelse af mikrofluidik, nye kamre og mikro-enheder blevet undersøgt som et instrument til at undersøge celle bevægelse under interstitielle strømning eller kemotaxi ^15,16. Under disse nye enheder blev nye celle metrikker indføres og undersøgt, ligesom virkningen af forskydningsspænding på en celle ^17,18. Desværre, tidligere og nuværende mikrofluide kemotaksi kamre begrænsede studier af cellemigration til 2D substrater-en vigtig tilbageslag da mange biologiske processer, herunder tumorcelleinvasion og metastase, og immune cellemigration, involverer 3D migration.

Direkte observationskamre-hvor en kemoattraktant opløsning er i kontakt med et 3D gel indeholdende celler er også blevet også rapporteret ^19,20. Disse kamre har to rum, hvoraf det ene indeholder en kemoattraktant og en indeholdende celler, er forbundet ved siden af hinanden horisontalt ²¹ eller som koncentriske ringe ^22. Disse systemer er spidse i den rigtige retning, men ikke holde et kemotaksi-system i en længere periode.

Desuden har forskere også undersøgt diffusivitet gennem kollagenmembraner i dialyse celler, såvel som diffusion af tracer molekyler gennem kollagen, der underkastes hydrostatisk tryk ^23-25. Nogle diffusionsforsøg i kollagengeler afhængige fysiske og kemiske modifikationer af gelen under anvendelse af magnetfelter og kemisk inkorporering ^26. En populær metode til at modellere diffusivitet i Collagenous væv afhængig af fluorescens billeddannelse af kontinuerlig punkt fotoblegning. Denne metode har vist anisotropi i diffusionskoefficienterne af makromolekyler i orienterede kollagene væv. Alligevel har fotoblegning blevet anvendt i ledbrusk og ikke collagenmatricer. Mens lignende, skal de fornødne modellering eksperimenter udføres gennem specifikt forstå diffusionskoefficient kollagengeler. Endnu vigtigere er, kan systemerne ikke udnytte en metode til at måle celle force generation.

Desværre synes de fleste systemer til at mangle et eller to centrale elementer for et ideelt system: Den giver mulighed for celle sporing, en diffusion gradient forståelse med en kemotaktisk faktor gennem matricen, et relativt simpelt sæt op med en lethed i reproducerbarhed, minimering af celle-celle-interaktioner, og evnen til at måle dimensionale enheder til kvantificering (dvs. hastighed, kraft, specifik koncentration). Moghe et al. </em> ²⁷ foreslået et system, der opfyldte de fleste af disse krav, hvor celler blev oprindeligt dispergeret i hele gelen snarere end koncentreret på filteroverfladen, men var vanskeligt at måle kræfter, cellen genererer.

Til dette formål præsenterer vi et plant gradient diffusion system til at undersøge kemotaxi i en 3D-collagenmatrix, som gør det muligt at overvinde moderne diffusionskammer begrænsningerne i de eksisterende assays, der er baseret på time-lapse mikroskopi, kombineret med billedanalyse teknikker til at måle celle kræfter i et 3D-miljø. Denne protokol giver en enkel, men innovativ måde at skabe en simpel 3D diffusionskammer, der kan bruges til at undersøge 3D kemotaksi i forskellige celler.

Protocol

1. 3D Mold Design og dele Mold Før du arbejder, får en silikone elastomer kit, en levende celle imaging kammer, en 22 mm dækglas, og en bearbejdet aluminium terning med dimensioner 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Forbered levende celler kammer til formning ved at placere dækglasset i bunden holderen og samling resten af ​​kammeret som anvist af sælgeren. Dernæst bruger pincet, placeres bearbejdet aluminium metal terning i midten af ​​den levende celle imaging kammer boliger og p…

Representative Results

Evnen af ​​dette assay præcist at vurdere migrationen af ​​cellen er afhængig af en god opsætning af systemet. Derfor er det kritisk for Sørg for at designe diffusion systemet formen præcist og stor omhu i at placere både hydrofobe og hydrofile dækglas, som illustreret i figur 1. Hvis systemet er korrekt udformet og under diffusion modellering stadium sikrer at finde en meget god lineær startlinien, man er i stand til at opnå rart fluorescerer billeder, som vist i figur 2,</stro…

Discussion

De mest kritiske trin for succesfulde diffusionsforsøg med eller uden celler er: korrekt opsætning formen forsamlingsfriheden; at udvikle den nødvendige håndelag for at forhindre skader under udvinding af hydrofobe dækglas; sikre at finde en meget god lineær startlinjen til korrekt at beregne diffusionskoefficienten; korrigere eksperimentelle beregninger af både kollagen og kemoattraktant; korrekt brug af levende celler for at sikre matrix ikke tørre ud; og opretholde en steril, sund kultur.

<p class="jove_c…

Materials

Silicone elastomer kit	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	CMB for 18mm round coverslips
22mm Glass Coverslip	Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife	X-Acto	X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc	00216A-10	Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube	Fisher Scientific	14-432-22	Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass petri dish	Fisher Scientific	08-747A	Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)
Forceps	Fisher Scientific	22-327-379	Fine Point Forceps
Cover glasses	Fisher Scientific	12-518-105A	Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl	Gelest	SIT8174.0
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane	Sigma-Aldrich	296090	Hexane
			anhydrous, 95%
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool	Lunzer	PV-081-3	Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length
Vacuum grease	Dow Corning	14-635-5C	High-Vacuum Grease
15 ml tube	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10X phosphate buffered solution	Fisher Scientific	BP399-500	1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1N sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	38215	Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail	BD Biosciences	354236	Rat tail
Micro centrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-332	Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped
Carboxylate-modified microspheres	Invitrogen	F-8813	Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamine B for fluorescence