Planar Gradient système de diffusion d'enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D
Summary
Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.
Abstract
The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.
Introduction
Le mouvement préféré de cellules vers un gradient de concentration, connu comme le chimiotactisme, joue un rôle important dans les processus physiologiques et pathologiques dans le corps. De tels exemples sont la peau et les muqueuses une cicatrisation des plaies, la morphogenèse 2, 3 inflammation, et 4,5 de la croissance tumorale. Il a également été montré que les cellules cancéreuses peuvent migrer à travers les deux stratégies de migration de cellule 6 individuels et collectifs. En outre, des mécanismes d'instabilité diffusionnels peuvent induire la séparation des cellules individuelles ou groupées d'un corps / objet tumorale et peuvent ensuite immigrer vers une source de nutriments et donc envahir des zones plus vastes et les tissus 7.
En outre, il a été montré que divers mécanismes de migration peuvent être actifs en 2D et en 3D, en raison de différents rôles des molécules d'adhésion 8. Par conséquent, un passage à physiologiquement pertinente des essais in vitro pour étudier la motilité cellulaire dans un measureable et de façon simple est d'importance dans la compréhension de mouvement cellulaire phénomènes 9. Malheureusement, la difficulté à analyser la migration cellulaire, un test complet de chimiotactisme quantifiable nécessite habituellement une longue méthode laborieuse, fondée sur la mesure des modèles de la motilité cellulaire et les phénomènes de transport impartiaux.
Approches expérimentales passées pour enquêter sur la chimiotaxie de cellules comprennent la chambre de Boyden 10 et le titre d'essai agarose 11. Cependant, dans ces premiers essais, des expériences de migration cellulaire ne surveillaient pas le mouvement dans le temps. De plus, surtout, les gradients de concentration utilisées pour les expériences ne sont pas bien définies ou complètement compris, tandis que seulement le maintien de la signalisation de pas plus de quelques heures. En outre, chimiotaxie début tentatives de chambre restreinte migration cellulaire à deux dimensions et ne permettent de surveiller la cinétique de la migration 12. En regardant la chambre de Boyden, un test de point de terminaisonne permettrait pas au chercheur d'observer visuellement la migration et ne pouvait pas différencier directement chimiotaxie (mouvement directionnel) de chimiokinèse (mouvement aléatoire). En outre, plusieurs des variables-différences dans la taille des pores et l'épaisseur des membranes réalisés à la chambre très difficile à reproduire facilement dissimulés et la réaction des cellules migrant vers les chimiokines 13,14.
Avec la nouvelle compréhension de la microfluidique, de nouvelles chambres et micro-dispositifs ont été étudiés comme un instrument pour étudier la locomotion cellulaire dans des conditions d'écoulement interstitiels ou chimiotactisme 15,16. En vertu de ces nouveaux appareils, de nouvelles mesures de cellules ont été introduits et étudiés, comme l'effet de la contrainte de cisaillement sur une cellule 17,18. Malheureusement, les chambres de chimiotactisme microfluidiques précédents et actuels études de la migration des cellules limitées à des substrats 2D-un recul important puisque de nombreux processus biologiques, y compris l'invasion et la métastase de cellules tumorales, et imla migration cellulaire mune, implique la migration 3D.
Chambres, où d'observation directe d'une solution de chimioattractant est en contact avec un gel 3D contenant des cellules ont également été également rapporté 19,20. Ces chambres ont deux compartiments, l'un contenant un chimioattractive et l'un contenant des cellules, sont reliés côté de l'autre horizontalement 21 ou 22 anneaux concentriques. Ces systèmes sont pointés dans la bonne direction, mais ne gardent pas un système de chimiotactisme pour une période de temps prolongée.
En outre, les chercheurs ont également examiné la diffusivité à travers des membranes de collagène dans des cellules de dialyse, ainsi que la diffusion de molécules de traceur à travers des échantillons de collagène est soumis à une pression hydrostatique de 23 à 25. Des expériences de diffusion dans des gels de collagène reposent sur des modifications physiques et chimiques du gel à l'aide de champs magnétiques et incorporation chimique 26. Une méthode populaire pour la modélisation de diffusion dans collatissus Genous repose sur l'imagerie de fluorescence du point photoblanchiment continue. Cette méthode a révélé une anisotropie dans les coefficients de diffusion des macromolécules dans les tissus de collagène orientées. Cependant, photoblanchiment a été utilisé dans le cartilage articulaire et les matrices de collagène non. Bien que semblable, les expériences de modélisation nécessaires doivent être effectuées par la compréhension spécialement le coefficient de diffusion de gels de collagène. Plus important encore, les systèmes ne pas utiliser un procédé de mesure de génération de force de cellule.
Malheureusement, la plupart des systèmes semblent manquer un ou deux éléments clés pour un système idéal: l'permettant de suivi de la cellule, une compréhension de gradient de diffusion avec un facteur chimiotactique à travers la matrice, un ensemble relativement simple avec une facilité de reproductibilité, la minimisation de interactions cellule-cellule, et la capacité de mesurer les unités de mesure pour la quantification (c., la vitesse, la force, la concentration spécifique). Moghe et al. </em> 27 proposé un système qui accomplit la plupart de ces exigences, dans lequel les cellules sont initialement dispersées dans le gel plutôt que concentrés sur la surface du filtre, mais il était difficile de mesurer les forces qui génère la cellule.
Pour cette fin, nous présentons un système de diffusion de gradient plane pour enquêter sur la chimiotaxie dans une matrice de collagène en 3D, qui permet de surmonter modernes limitations de la chambre de diffusion de tests existants, qui est basé sur la microscopie time-lapse, couplées avec des techniques d'analyse d'images pour mesurer cellulaire forces dans un environnement 3D. Ce protocole fournit un moyen simple, mais innovant de création d'une chambre de diffusion 3D simple qui peut être utilisé pour étudier la chimiotaxie 3D dans des cellules différentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques pour les expériences réussies de diffusion avec ou sans cellules sont: configurer correctement l'ensemble de moule; le développement de la dextérité manuelle nécessaire pour empêcher des dommages lors de l'extraction des lamelles hydrophobes; assurer de trouver une très bonne ligne de départ linéaire pour calculer correctement le coefficient de diffusion; corriger les calculs expérimentaux de collagène et chimioattractive; utiliser correctement de système d'imageri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.
Materials
| Silicone elastomer kit | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | a two-part misture with a 10:1 mix |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | CMB for 18mm round coverslips |
| 22mm Glass Coverslip | Fisher Scientific | NC0180281 | Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5 |
| Machined aluminum metal cube | |||
| Hobby utility knife | X-Acto | X3201 | |
| 3-(aminopropyl) trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778-5ML | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc | 00216A-10 | Glutaraldehyde, EM Grade, 8% |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Standard floor model and tabletop centrifuges |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm) |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327-379 | Fine Point Forceps |
| Cover glasses | Fisher Scientific | 12-518-105A | Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1 |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Acetic acid ACS reagent, ≥99.7% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | Hexane |
| anhydrous, 95% | |||
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| High-precision diamond scribing tool | Lunzer | PV-081-3 | Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length |
| Vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5C | High-Vacuum Grease |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface |
| 10X phosphate buffered solution | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer |
| 1N sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 38215 | Sodium hydroxide concentrate |
| Collagen I, rat tail | BD Biosciences | 354236 | Rat tail |
| Micro centrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-332 | Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped |
| Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B for fluorescence |
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