평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해
Summary
Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.
Abstract
The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.
Introduction
화학 주성으로 공지 된 농도 구배를 향해 세포의 바람직한 움직임, 신체의 병리 생리 학적 과정에 중요한 역할을한다. 이러한 예로는 피부와 점막 상처 치유 1, 2 형태 형성, 염증 3 및 종양 성장 4,5-이다. 또한, 암세포가 모두 개인과 단체 셀 마이그레이션 전략 1-6 이주 할 수 있다는 것으로 알려져있다. 또한, 확산 불안정성 메커니즘 영양소 원을 향해 이민 따라서 넓은 영역 및 조직 7 침입 수 후 종양 바디 / 물체로부터 단일 클러스터 또는 세포의 분리를 유도하고있다.
또한, 다양한 이동 메커니즘으로 인해 부착 분자 (8)의 다른 역할로, 2 차원에서 3 차원으로 활성화 될 수 있음을 보여왔다. 따라서, 체외 분석에 생리 학적으로 관련에 이동 measureabl에서 세포 운동성을 조사하기 위해즉 간단한 방법은 세포 이동 현상 이해 9에 중요하다. 불행히도, 세포 이동을 분석하는데 어려움이 광범위한 정량 화성 분석은 일반적으로 공평한 세포 운동성 및 이동 현상 모델의 측정에 기초하고 긴 힘드는 방법을 필요로한다.
세포의 화학 주성을 조사하기 위해 과거의 실험 방법은 보이든 챔버 (10)와 아래 아가로 오스 분석 (11)를 포함한다. 그러나, 이러한 초기 분석에서, 세포 이동 실험은 시간에 관하여 움직임을 모니터하지 않았다. 더 중요한 것은, 실험에 사용 된 농도 기울기는 잘 정의되지 않은 또는 몇 시간보다 더 대한 시그널링을 유지하면서 완전히 이해했다. 또한, 초기 화성 챔버 시도는 두 가지 차원으로 세포의 이동을 제한 한 마이그레이션 (12)의 반응 속도를 모니터링하는 것을 허용하지 않았다. 보이든 챔버를 보면, 엔드 포인트 분석연구원은 시각적으로 마이그레이션을 관찰하는 것을 허용하지 것이다 직접 chemokinesis (랜덤 이동)에서 화성 (방향 이동)를 구별 할 수 없습니다. 또한, 기공의 크기와 두께의 여러 변수-차이 쉽게 재현하는 것은 매우 어렵다 챔버 막은 제 13, 14 및 케모카인에 세포 이주 반응을 은폐.
마이크로 유체의 새로운 이해와 함께, 새로운 챔버 및 마이크로 디바이스는 간질 흐름 조건 하에서 세포의 운동을 조사하기 위해 수단으로 조사 또는 15, 16 화학 주성되었다. 이 새로운 디바이스에서 새로운 셀 메트릭스 도입 및 셀 (17, 18)에 전단 응력의 효과처럼, 조사했다. 불행하게도, 과거와 현재의 미세 유체 화성 챔버는 종양 세포의 침윤과 전이, 메신저 등 많은 생물학적 과정, 이후 2D 기판-중요한 후퇴로 세포 이동의 연구를 제한무네 세포 이동은, 3D 이동을 포함한다.
직접적인 관찰 챔버 – 여기서, 화학 유인 물질 용액은 세포를 포함하는 3 차원 겔과 접촉하고 또한도 19, 20를보고되었다. 이 챔버는 수평으로 서로 (21) 옆에 또는 동심 링 (22)로 결합되어, 두 개의 구획, 화학 유인 물질을 함유 한 세포를 포함하는 하나 있습니다. 이러한 시스템은 오른쪽 방향으로 지적되지만, 장기간의 화학 주성 시스템을 유지하지 않는다.
또한, 연구진은 투석 셀뿐만 아니라 정수압 23-25 실시 콜라겐 샘플 트레이서 통해 분자의 확산 콜라겐 막을 통해 확산 성을 조사 하였다. 콜라겐 겔 일부 확산 실험은 자기장과 화학 결합 (26)을 이용하여 겔의 물리적 및 화학적 변형에 의존한다. COLLA에 확산 모델링을위한 인기있는 방법genous 조직 연속 포인트 광표백의 형광 이미징을 사용합니다. 이 방법은 중심의 콜라겐 조직에서 거대 분자의 확산 계수의 이방성을 밝혔다. 그러나, 광표백은 관절 연골에서 사용되지 행렬 콜라겐되었다. 유사하지만, 필요한 모델 실험은 특히 콜라겐 겔의 확산 계수의 이해를 통해 수행되어야한다. 더 중요하게, 시스템은 셀 구동력 발생을 측정하는 방법을 이용하지 않는다.
불행히도, 대부분의 시스템은 이상적인 시스템에 대한 하나 또는 두 핵심 요소가 누락 될 것 같다 : 셀 추적, 매트릭스, 재현성 용이 비교적 간단한 셋업의 최소화를 통해 화성 인자와 확산 그라데이션 이해의 허용 상호 작용 세포 – 세포, 및 치수 정량 단위 (즉, 속도, 힘, 특정 농도)를 측정 할 수있다. Moghe 등은. </em> 27 세포가 초기에 겔을 통해 분산보다는 필터 표면에 농축 된 대부분의 요구 사항을 충족하는 시스템을 제안하지만, 세포가 생성하는 힘을 측정하는 것이 곤란했다.
이 목적을 위해, 우리는 하나의 셀을 측정하는 영상 분석 기술과 결합 경과 현미경에 기초 기존 분석법, 현대 확산 실 한계를 극복 할 수있는 3D 콜라겐 매트릭스의 주 화성을 조사하는 평면 구배 확산 시스템을 제시 3D 환경에서 힘. 이 프로토콜은 서로 다른 셀에서 3D 화성을 조사하는 데 사용될 수있는 간단한 3D 확산 실을 만드는 간단하면서도 혁신적인 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
또는 세포없이 성공적으로 확산 실험을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 올바르게 금형 조립을 설정하는 단계; 소수성 커버 슬립의 추출시 파손을 방지하기 위해 필요한 손재주를 현상하는 단계; 올바르게 확산 계수를 계산하기 매우 좋은 선형 시작 라인을 찾을 수 있도록; 콜라겐과 화학 유인 물질 모두의 실험적인 계산을 수정; 제대로 건조하지 않는 행렬을 보장하기 위해 라이브 세포…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.
Materials
| Silicone elastomer kit | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | a two-part misture with a 10:1 mix |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | CMB for 18mm round coverslips |
| 22mm Glass Coverslip | Fisher Scientific | NC0180281 | Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5 |
| Machined aluminum metal cube | |||
| Hobby utility knife | X-Acto | X3201 | |
| 3-(aminopropyl) trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778-5ML | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc | 00216A-10 | Glutaraldehyde, EM Grade, 8% |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Standard floor model and tabletop centrifuges |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm) |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327-379 | Fine Point Forceps |
| Cover glasses | Fisher Scientific | 12-518-105A | Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1 |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Acetic acid ACS reagent, ≥99.7% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | Hexane |
| anhydrous, 95% | |||
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| High-precision diamond scribing tool | Lunzer | PV-081-3 | Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length |
| Vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5C | High-Vacuum Grease |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface |
| 10X phosphate buffered solution | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer |
| 1N sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 38215 | Sodium hydroxide concentrate |
| Collagen I, rat tail | BD Biosciences | 354236 | Rat tail |
| Micro centrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-332 | Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped |
| Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B for fluorescence |
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