Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

Summary

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Abstract

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Introduction

El movimiento preferido de las células hacia un gradiente de concentración, conocido como quimiotaxis, juega un papel importante en los procesos patológicos y fisiológicos en el cuerpo. Tales ejemplos son la piel y la mucosa cicatrización de la herida ^{1, 2} morfogénesis, la inflamación ^3, y ^4,5 el crecimiento del tumor. También se ha demostrado que las células cancerosas pueden migrar a través de ambas estrategias individuales y colectivas a la migración celular ^6. Además, los mecanismos de inestabilidad difusionales pueden inducir la separación de células individuales o agrupados a partir de un cuerpo / objeto tumoral y luego puede emigrar hacia una fuente de nutrientes y por lo tanto invadir áreas ⁷ y tejidos más amplios.

Además, se ha demostrado que diversos mecanismos de migración pueden ser activos en 2D y en 3D, debido a las diferentes funciones de las moléculas de adhesión ^8. Por lo tanto, un movimiento para fisiológicamente relevante en ensayos in vitro para investigar la motilidad celular en un measureabley manera simple es de importancia en la comprensión de los fenómenos movimiento celular ^9. Desafortunadamente, la dificultad en el análisis de la migración celular, un ensayo de quimiotaxis integral cuantificable por lo general requiere un método laborioso de largo, fundada en la medición de los modelos de la motilidad celular y los fenómenos de transporte imparciales.

Enfoques experimentales anteriores para investigar la quimiotaxis de células incluyen la cámara de Boyden ¹⁰ y el que se ensaya agarosa ^11. Sin embargo, dentro de estos primeros ensayos, los experimentos de migración celular no controlan el movimiento con respecto al tiempo. Más, importante, los gradientes de concentración utilizados para los experimentos fueron bien definidos o no completamente entendidas, mientras que sólo el mantenimiento de la señalización por no más de unas pocas horas. Por otra parte, los intentos de la cámara de quimiotaxis temprana restringen la migración de células de dos dimensiones y no permitieron una para supervisar la cinética de la migración ^12. En cuanto a la cámara de Boyden, un ensayo de punto finalno permitiría al investigador para observar la migración visualmente y no podía diferenciar directamente quimiotaxis (movimiento direccional) de chemokinesis (movimiento aleatorio). Además, varias variables diferencias en el tamaño de poro y el grosor de las membranas hechos a la cámara muy difícil de reproducir fácilmente y ocultan la reacción migrante de las células a quimiocinas ^13,14.

Con la nueva comprensión de la microfluídica, nuevas cámaras y micro-dispositivos se han investigado como un instrumento para investigar la locomoción celular bajo condiciones de flujo intersticiales o quimiotaxis ^15,16. Bajo estos nuevos dispositivos, nuevas métricas de células se introdujeron e investigados, como el efecto del esfuerzo cortante en un celular ^17,18. Desafortunadamente, las cámaras de quimiotaxis de microfluidos pasadas y actuales limitan estudios de la migración de células a los sustratos-2D un retroceso importante ya que muchos procesos biológicos, incluyendo la invasión celular tumoral y la metástasis, y immigración celular inmune, implica la migración 3D.

-Cámaras donde una solución quimioatrayente está en contacto con un gel que contiene células 3D también han sido reportados también observación directa ^19,20. Estas cámaras tienen dos compartimentos, uno que contiene un quimioatrayente y uno que contiene células, se unió al lado de uno otro horizontalmente ²¹ o como anillos concéntricos ^22. Estos sistemas se apuntaban en la dirección correcta, pero no mantienen un sistema de quimiotaxis por un período prolongado de tiempo.

Además, los investigadores también han examinado la difusividad a través de membranas de colágeno en las células de diálisis, así como la difusión de moléculas trazadoras a través de muestras de colágeno sometido a la presión hidrostática ^23-25. Algunos experimentos de difusión en geles de colágeno se basan en modificaciones físicas y químicas del gel utilizando campos magnéticos y la incorporación química ^26. Un método popular para modelar difusividad en collatejidos indíge- se basa en la imagen de fluorescencia de fotoblanqueo punto continuo. Este método ha revelado anisotropía en los coeficientes de difusión de macromoléculas en tejidos de colágeno orientadas. Sin embargo, photobleaching se ha utilizado en el cartílago articular y no colágeno matrices. Aunque similares, los experimentos de modelización necesarias deben ser realizadas a través de la comprensión específicamente el coeficiente de difusión de los geles de colágeno. Más importante aún, los sistemas no utilizan un método para medir la generación de fuerza de la célula.

Desafortunadamente, la mayoría de los sistemas parecen faltar uno o dos elementos clave para un sistema ideal: la que permite el seguimiento de la célula, una comprensión gradiente de difusión con un factor quimiotáctico través de la matriz, relativamente sencilla configuración con una facilidad de la reproducibilidad, la minimización de interacciones célula-célula, y la capacidad de medir unidades dimensionales para la cuantificación (es decir, velocidad, fuerza, concentración específica). Moghe et al. </em> ²⁷ propuso un sistema que cumple la mayoría de estos requisitos en el que las células se dispersan inicialmente en todo el gel en lugar de concentrados en la superficie del filtro, pero era difícil de medir las fuerzas que la célula genera.

Para este propósito, se presenta un sistema de difusión de gradiente plana para investigar la quimiotaxis en una matriz de colágeno en 3D, lo que permite superar las limitaciones modernas cámara de difusión de los ensayos existentes, que se basa en la microscopía de lapso de tiempo, junto con las técnicas de análisis de imagen para medir celular fuerzas en un entorno 3D. Este protocolo proporciona una manera simple, pero innovadora de la creación de una cámara de difusión 3D simple que se puede utilizar para investigar la quimiotaxis 3D en diferentes células.

Protocol

Diseño de molde 1. 3D y Refacciones Molde Antes de trabajar, obtener un kit de elastómero de silicona, una cámara de imágenes de células vivas, un cubreobjetos de vidrio de 22 mm, y un cubo de metal de aluminio mecanizado con dimensiones de 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Prepare la cámara de imágenes de células vivas para el moldeo mediante la colocación de cubreobjetos en el soporte inferior y el montaje del resto de la cámara de la manera indicada por el vendedor. A continuación…

Representative Results

La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión la migración de la célula depende de una buena configuración del sistema. Por lo tanto, es fundamental para el maquillaje asegúrese de diseñar el molde sistema de difusión precisa y tener mucho cuidado en la colocación de cubreobjetos tanto hidrofóbicos e hidrofílicos, como se ilustra en la Figura 1. Si el sistema está diseñado correctamente y durante la etapa de modelado asegurando la difusión de encontrar una muy buena línea de salid…

Discussion

Los pasos más críticos para experimentos de difusión de éxito con o sin células son: establecer correctamente el conjunto de molde; el desarrollo de la destreza manual necesaria para evitar daños durante la extracción de cubreobjetos hidrófobos; asegurando que encontrar una muy buena línea de salida lineal para calcular correctamente el coeficiente de difusión; corregir los cálculos experimentales de colágeno y quimioatrayente; utilizar correctamente el sistema de imágenes de células vivas para asegurar la…

Materials

Silicone elastomer kit	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	CMB for 18mm round coverslips
22mm Glass Coverslip	Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife	X-Acto	X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc	00216A-10	Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube	Fisher Scientific	14-432-22	Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass petri dish	Fisher Scientific	08-747A	Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)
Forceps	Fisher Scientific	22-327-379	Fine Point Forceps
Cover glasses	Fisher Scientific	12-518-105A	Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl	Gelest	SIT8174.0
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane	Sigma-Aldrich	296090	Hexane
			anhydrous, 95%
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool	Lunzer	PV-081-3	Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length
Vacuum grease	Dow Corning	14-635-5C	High-Vacuum Grease
15 ml tube	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10X phosphate buffered solution	Fisher Scientific	BP399-500	1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1N sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	38215	Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail	BD Biosciences	354236	Rat tail
Micro centrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-332	Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped
Carboxylate-modified microspheres	Invitrogen	F-8813	Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamine B for fluorescence