Ett förenklat system för utvärdering Cell Mechanosensing och Durotaxis<em> In Vitro</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
Kompositionen och mekaniska egenskaperna hos den extracellulära matrisen är mycket variabla mellan vävnadstyper. Denna bindväv stroma mångfald kraftigt påverkan cellens beteende för att reglera normala och patologiska processer inklusive celltillväxt, differentiering, vidhäftning signalering och riktad migration. I detta avseende, att den inneboende förmågan hos vissa celltyper migrerar mot en styvare eller mindre eftergivliga matrissubstratet benämnes durotaxis. Detta fenomen spelar en viktig roll under fosterutvecklingen, sårreparation och cancercellinvasion. Här beskriver vi en enkel analys för att studera durotaxis, in vitro, användning av polydimetylsiloxan (PDMS) substrat. Framställning av den beskrivna durotaxis kamrarna skapar en styvhet gränssnitt mellan den relativt mjuka PDMS gel och en stel täckglas. I exemplet har vi använt dessa durotaxis kammare för att visa en roll för cdc42 / RAC1 GTPase aktiverande protei, cdGAP i mechanosensing och durotaxis reglering i mänskliga U2OS osteosarkomceller. Denna analys kan lätt anpassas till andra typer och / eller knockdown av andra proteiner intressecell att utforska sina respektive roller i mechanosignaling och durotaxis.
Introduction
Den extracellulära matrisen (ECM) är sammansatt av en komplex matris av strukturella och tvärbindnings proteiner inkluderande kollagen, fibronektin och laminin. Även om det är väl etablerat att ECM ger viktiga strukturellt stöd för cellulära vävnader, det finns allt fler bevis som tyder på att celler aktivt svara på fysiska förändringar i sin ECM miljö att reglera olika cellulära processer, inklusive cellöverlevnad, differentiering och cellmigration. Till exempel kan skillnader i styvhet ECM driva mesenchymala stamceller mot olika härstamningar, med mjuka substrat (~ 1 kPa) främjar neurogena härstamningar medan styva (~ 25 kPa) substrat främja osteogen differentiering 1. På liknande sätt har en ökning av den stromala matrisen styvhet visats befrämja juver epitelceller tumorigenes och invasion in i den omgivande vävnaden 2,3.
En särskilt intressant aspekt av denna mechanosignAling aktivitet resulterar i en process som kallas durotaxis, i vilka celler migrerar företrädesvis mot en mer styvt substrat 4,5. Celler ständigt känner de fysiska egenskaperna hos deras extracellulära miljön genom integrinreceptorbindning till ECM. Detta, i sin tur, gynnar ansamling av många strukturella och signalerande proteiner till sina cytoplasmatiska domäner för att driva bildningen av vidhäftande strukturer kända som fokala kontakter eller fokala kontakter 6,7. Eftersom integriner har någon inneboende enzymatisk aktivitet, signaler förmedlas från ECM genom dessa proteiner att samordna cellens svar på deras föränderlig miljö 8. Följaktligen är identifiering och karakterisering av de viktigaste proteiner involverade i regleringen mechanosignaling och durotaxis ett viktigt område för utredning.
Olika modellsystem har utvecklats för att studera durotaxis in vitro, men de flesta harutnyttjade kollagenbelagda polyakrylamid substrat 4. Emellertid kan framställningen av polyakrylamid substraten vara tekniskt utmanande och kollagenet som användes i dessa analyser måste vara kemiskt tvärbunden till substratet 9. Polydimetylsiloxan (PDMS) substrat har visat sig uppvisa jämförbara mekaniska egenskaper till polyakrylamid substraten 10. Emellertid är PDMS substrat framställes genom enkel blandning av ett förhållande av basen för att tvärbindningsmedel och dessa substrat kan beläggas med ECM-proteiner utan behov av kemisk tvärbindning, vilket gör PDMS ett enklare verktyg för att studera effekterna av styvhet på cellbeteende. Häri beskriver vi hur du förbereder en enkel durotaxis kammare, i vilken en mjuk PDMS substrat är integrerad med en stel glastäck.
Analysen, som beskrivs nedan, ger en snabb och enkel metod för att studera durotaxis. För denna studie har vi använt humana U2OS osteosarkomceller kombination med siRNA-medieradknockdown av cdGAP att studera betydelsen av detta fokus adhesionsprotein i durotaxis 11. Viktigt, kan detta protokoll lätt anpassas till individuella behov. Andra celltyper kan användas i stället för U2OS cellerna och vilket protein som helst kan slås ner eller överuttryckt att bestämma effekterna på cellbeteende under durotaxis. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att införliva fluorescerande taggade proteiner för att analysera deras dynamik och beteenden med hjälp av FRAP eller FRET metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri beskriver vi en enkel analys för att studera durotaxis i migrera celler. En stor styrka med denna analys är det lätt att framställa durotaxis kamrarna med hjälp av PDMS. Styvheten av substraten lätt kan manipuleras genom att ändra förhållandet av PDMS baslösningen till tvärbindare för att medge studier av olika trögheter i analysen. Men det är en potentiell begränsning av systemet som cellerna är utsatta för endast en enda förändring i substrat styvhet i stället för att uppleva en styvhet grad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH R01 GM47607, CA163296 och NSF 1334493 till CET. Vi tackar medlemmar i Turner laboratorium för kritisk läsning av manuskriptet. Alla data som visas i denna rapport återges med tillstånd från Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
