Um sistema simplificado para a Avaliação celular Mechanosensing e Durotaxis<em> In Vitro</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
As propriedades mecânicas da composição e da matriz extracelular são altamente variáveis entre tipos de tecidos. Este tecido conjuntivo diversidade estroma grandemente impactos comportamento celular para regular os processos normais e patológicos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, migração e adesão de sinalização direccional. A este respeito, a capacidade inata de determinados tipos de células para migrar em direcção um substrato mais rígido, ou menos complacente matriz é referida como durotaxis. Este fenómeno desempenha um papel importante durante o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e a invasão de células do cancro. Aqui, nós descrevemos um ensaio simples para estudar durotaxis, in vitro, utilizando PDMS (polidimetilsiloxano) substratos. Preparação do descrito durotaxis câmaras cria uma interface entre a rigidez do gel PDMS relativamente macio e uma lamela de vidro rígida. No exemplo fornecido, temos usado estes durotaxis câmaras para demonstrar um papel para o cdc42 / Rac1 GTPase ativando proteem, cdGAP, em mechanosensing e durotaxis regulamentação em células U2OS osteossarcoma humano. Este ensaio é facilmente adaptável a outros tipos e / ou knockdown de outras proteínas de interesse celulares para explorar seus respectivos papéis na mechanosignaling e durotaxis.
Introduction
A matriz extracelular (ECM) é constituído por uma matriz complexa de proteínas estruturais e de reticulação, incluindo colagénio, fibronectina e laminina. Embora seja bem estabelecido que a ECM fornece um suporte estrutural importante para os tecidos celulares, há evidências crescentes de que indicam que as células respondem activamente a mudanças físicas no seu ambiente de ECM para regular processos celulares, incluindo diversas sobrevivência celular, diferenciação e migração da célula. Por exemplo, diferenças na rigidez do ECM podem conduzir as células estaminais mesenquimais para linhagens diferentes, com substratos macios (~ 1 kPa) a promoção de linhagens neurogénicos enquanto substratos rígidos (~ 25 kPa) promover a diferenciação osteogénica 1. Da mesma forma, foi demonstrado um aumento na rigidez da matriz estromal para promover a tumorigénese célula epitelial mamaria e invasão do tecido circundante 2,3.
Um aspecto particularmente interessante deste mechanosignaling resultados da actividade em um processo conhecido como durotaxis, em que as células migram preferencialmente para um substrato mais rígido 4,5. Células sentir constantemente as características físicas do ambiente extracelular através da ligação do receptor de integrina ao ECM. Este, por sua vez, promove a acumulação de numerosas proteínas estruturais e de sinalização para os seus domínios citoplasmáticos para conduzir a formação de estruturas adesivas conhecidas como adesões focais ou contactos focais 6,7. Dado que as integrinas não têm actividade enzimática inerente, os sinais são transmitidos a partir do ECM através destas proteínas acessórias para coordenar a resposta da célula ao seu ambiente em mudança 8. Consequentemente, a identificação e caracterização das proteínas-chave envolvidas na regulação mechanosignaling durotaxis e é uma área importante de investigação.
Vários sistemas de modelos têm sido desenvolvidos para estudar durotaxis in vitro, mas a maioria têmutilizados substratos de poliacrilamida revestidos com colagénio 4. No entanto, a preparação dos substratos de poliacrilamida pode ser tecnicamente exigente e o colagénio utilizado nestes ensaios devem ser quimicamente reticulado ao substrato 9. Polidimetilsiloxano (PDMS) substratos têm mostrado exibir propriedades mecânicas comparáveis aos substratos de poliacrilamida a 10. No entanto, os substratos PDMS são preparadas simplesmente misturando uma proporção de base para o agente de reticulação e esses substratos podem ser revestidos com proteínas de ECM sem a necessidade de reticulação química, tornando assim mais fácil PDMS uma ferramenta para estudar os efeitos de rigidez no comportamento de células. Aqui, nós descrevemos como preparar uma câmara durotaxis simples em que um substrato macio PDMS é integrado com uma lamela de vidro rígida.
O ensaio, conforme descrito abaixo, proporciona um método rápido e simples para estudar durotaxis. Para este estudo foram utilizadas células de osteossarcoma U2OS humanos, combinado com siRNA mediadaknockdown de cdGAP para estudar o papel desta proteína de adesão focal em durotaxis 11. É importante ressaltar que este protocolo pode ser facilmente adaptado às necessidades individuais. Outros tipos celulares podem ser substituídos para as células U2OS e qualquer proteína pode ser batido ou sobre-expresso para determinar os efeitos sobre o comportamento das células durante durotaxis. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para incorporar proteínas fluorescente etiquetado para analisar sua dinâmica e comportamento usando FRAP ou FRET abordagens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos um ensaio simples para estudar durotaxis em células migrando. Uma grande força deste ensaio é a facilidade de preparação das câmaras durotaxis utilizando PDMS. A rigidez dos substratos pode ser facilmente manipulado por alteração da proporção de solução de base de PDMS de agente de reticulação para permitir o estudo de vários elementos de rigidez no ensaio. No entanto, uma limitação potencial do sistema é que apenas as células são expostas a uma única mudança na rigidez do sub…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1334493 a CET. Agradecemos a membros do laboratório Turner para a leitura crítica do manuscrito. Todos os dados apresentados neste relatório foram reproduzidas com permissão a partir de 2014 11 Wormer et al..
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
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