رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
تجارب البروتين التي تستخدم الطيف الكتلي (MS) يمكن أن تكون مصممة لاستخدام إما غير المستهدفة (بندقية) أو الأساليب المستهدفة. البروتينات اكتشاف يعتمد عموما على بندقية من أسفل إلى أعلى MS، إما باستخدام طريقة الاستحواذ التي تعتمد على البيانات التقليدية، أو باستخدام واحدة من التقنيات بيانات مستقلة وضعت مؤخرا (على سبيل المثال، MS E، رقعة) 1،2. البروتينات البندقية هي أداة قوية لتحديد الببتيد الإنتاجية العالية وتقدير نسبي، ولكنه غير مناسب عموما لتقدير المطلق أو لاستهداف، ومجموعات صغيرة محددة (~ عشرات) من البروتينات. يتم تحديد طريقة MS غالبا ما تستخدم لالبروتينات المستهدفة رد فعل الرصد (SRM) لما له من حساسية عالية، وسرعة، ومجموعة ديناميكية 3-5. وتشمل بدائل لSRM رصد رد فعل مواز، الذي يستفيد من ذات الدقة العالية، والكامل MS مسح 6.
SRM عادة ما يتم إجراء باستخدام rever النانو تدفقالمرحلة سد عالية الأداء اللوني السائل (نانو-RP-LC) أداة بالإضافة إلى تأين electrospray نانو (النانو ESI) مصدر أيون تعلق على الثلاثي رباعية مطياف الكتلة (QQQ-MS). في تجربة نموذجية، يتم هضم البروتينات proteolytically العينة، ويتم فصل الببتيدات الناتجة chromatographically، المستوعبة، والمتأينة. ينتج عن ذلك من أيونات السلائف هي م / ض تصفيتها من قبل رباعي الأول (Q1) ومجزأة في رباعي الثاني (Q2) عن طريق الاصطدام بها مع الغاز الاصطدام. الأيونات جزء الناتجة م / في رباعي الثالث (Q3) وكميا من قبل dynode التي تمت تصفيتها ض. ويشار إلى كل زوج السلائف وتفتيت أيون لكمرحلة انتقالية، ويتم رصد كل انتقال لفترة زمنية محددة (زمن السكون، عادة 2-50 مللي ثانية). خلال LC-SRM، دورات QQQ-MS من خلال قائمة محددة مسبقا من التحولات (دورة العمل هو عادة ≤3 ثانية)، وأنتجت اللوني من كل انتقال.
الاستراتيجيه البديلةالمنشأ للبروتين الكمي وعادة ما تستخدم المناعية مثل نقطة البقع، البقع الغربية، ELISAs، ميكروأرس الأضداد، عكس المرحلة ميكروأرس البروتين، والمناعية ميكروفلويديك، ELISAs الرقمية، والمناعية على أساس microsphere 7. يمكن للأفضل المناعية يكون بشكل ملحوظ أكثر حساسية من LC-SRM، وعينة مرت من المناعية يمكن أن يكون أعلى بكثير من LC-SRM 5. ومع ذلك، يمكن أن تكون مكلفة المناعية تطوير و / أو مضيعة للوقت، ويمكن للفحوصات الناتجة تكون عرضة لعبر التفاعل و / أو تدخل، تتعارض مع خلية / تحلل الأنسجة / طرق التجانس، و / أو غير قابلة للمضاعفة 5،8. بعض من هذه القضايا يمكن معالجتها من خلال اقتران تقنيات الأضداد ومقرها MS. على سبيل المثال، والبروتينات المستهدفة يمكن إثراء باستخدام مناعي قبل التحلل البروتيني وLC-SRM 12/09. بدلا من ذلك، تقنية SISCAPA توظف مناعي لاحقا إلى التحلل البروتيني في LEVE الببتيدل 13،14. بالإضافة إلى immunoenrichment استراتيجيات، يمكن استخدامها immunodepletion من البروتينات وفرة عالية لزيادة حساسية LC-SRM عن طريق الحد من تدخل coeluting التحاليل 15،16.
ويمكن تقسيم يستند إلى MS-البروتين الكمي في الكمي النسبي والمطلق، وأيضا في وضع العلامات النظائر مستقرة وخالية من التسمية (على سبيل المثال، ووضع العلامات الأيضية، ووضع العلامات الكيميائية، والبروتين الثقيل وصفت والببتيد المعايير الداخلية). يمكن أن تقنيات خالية من التسمية أن تكون مفيدة للالنسبي البروتين الكمي، ولكن من غير مناسب لتقدير المطلق دقيقة. وعلى سبيل المقارنة، خفضت تقنيات الوسم الخطأ المرتبط إعداد العينات وMS التباين، وغالبا ما تستخدم للبروتين النسبي الكمي 17. على سبيل المثال، أعدت مستقر النظائر المسمى بروتيوم (SILAP) المعايير باستخدام خط الخلية البشرية مثقف تمكين الكمي النسبي من المؤشرات الحيوية المحتملة عن طريق LC-SRM من المصل البشري 18. دقيقة الكمي البروتين المطلق MS يتطلب أن النقى كميا، البروتين المسمى isotopically أو الببتيد المعايير الداخلية أن ارتفعت-في العينات البيولوجية قبل MS. إدراج النظائر الثقيلة المعايير الداخلية وصفت في سير عمل LC-SRM تمكن الكمي المطلق الذي ثبت أن تكون استنساخه للغاية وقابلة للتحويل بين المختبرات 16،19.
وتشمل النظائر المستقرة المعايير الداخلية وصفت لتقدير البروتين المطلق MS أعدت معايير الببتيد باستخدام التوليف الصلبة مرحلة 20 والبروتينات تتكون من متسلسلة معايير الببتيد البروتيني شطورة 21، والمعايير بروتين كامل طول 22. هدف التعديل البروتين التساهمية وإعداد نموذج غير مكتمل (أي غير مكتمل عينة تحلل والتجانس، وناقصة البروتين الإذابة، تمسخ، الألكلة، والتحلل البروتيني) يمكن أن تقوض التقدير الدقيق. ص الداخليهي المعايير rotein الأقل احتمالا أن تتأثر معظم هذه المشاكل المحتملة، ولكنها عادة ما تكون الأكثر صعوبة للاستعداد. بديل هو تحليل كل بروتين الهدف باستخدام معايير متعددة الببتيد الداخلية التي صممت لتشمل مواطني المرافقة بقايا جذر الأمينو وكربوكسي المحطة. بغض النظر عن التي يعمل نوع من معيار الداخلية، ينبغي أن ارتفعت-في العينات البيولوجية في أبكر وقت خلال إعداد عينة وقت ممكن. أيضا، يجب اختبار تقنيات إعداد عينة متعددة (على سبيل المثال، وظروف تمسخ مختلفة). استخدام أساليب فنية تجريبية متعامدة متعددة (تجريبي عبر التحقق من صحة) هو استراتيجية قابلة للتطبيق للتغلب على معظم الكمي المحتمل التحديات 23-25.
LC-SRM الكمي من البروتينات هي تقنية مرنة للغاية والتي تم استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات. والجدير بالذكر، وقد تم استخدامه لدراسة الببتيد وبروتين المؤشرات الحيوية داخلالعينات السريرية مثل مصل، الخزعات الأساسية، وشفاطات إبرة دقيقة 5. كما تم استخدام LC-SRM لقياس رياضيات الكيمياء من المجمعات بروتين 5،26، للكشف عن أعصاب البوتولينوم 27، لتحديد ديناميات البروتين الفسفرة ضمن مسارات إشارات 5، وتحديد التغيرات في التشكل البروتين 28.
مختبرنا يستخدم LC-SRM لتحديد البروتينات مما يشير إلى أن توسط الكيميائي البلاعم لدعم تطوير المحاكاة المسار الكيميائي. الخطة الشاملة للبروتوكول (الشكل 1) يبدأ مع مرتبة الببتيدات المستهدفة مؤقتة. وفي وقت لاحق، وقد تم تجميع معايير الببتيد الخارجية الخام واستخدامها لتطوير المقايسات LC-SRM للتحاليل نوعية العينات البيولوجية. إذا تم اكتشاف البيولوجي المستمدة من عينة الببتيد الهدف، تم إعداد معايير الببتيد الداخلية الثقيلة المسمى النقاء لالكمي LC-SRM. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لميلانcurately تحديد البروتينات من مجموعة واسعة من العينات البيولوجية، ودعم التحقيقات في طائفة واسعة من الأهداف البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
المطلق البروتين الكمي ضروري لمجموعة متنوعة جدا من التطبيقات الطبية الحيوية مثل التحقق من صحة العلامات البيولوجية ونقل الإشارة النمذجة الطريق. في الآونة الأخيرة، البروتينات المستهدفة باستخدام LC-SRM قد استفاد من التحسينات على تقنيات عديدة بما في ذلك إعداد الببتيد الق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
References
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
- Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
- Wild, D. . The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , (2013).
- Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
- Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
- Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
- Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
- Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
- Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
- Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
- Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
- Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
- Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
- Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. . Peptide synthesis and applications. , (2013).
- Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
- Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2001).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2013).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
- Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
- Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
- Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
- Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
- Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
- Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
- Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
- Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
- Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
- Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
- Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
- Alterman, M. A., Hunziker, P. . Amino acid analysis : methods and protocols. , (2012).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
- Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , (2010).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
- Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
- Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
- Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
- Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, S5 (2012).
- Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
- Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
- Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
- Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
- Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. . Mol Cell Proteomics. , .
