胞浆的定量与液泡<em>沙门氏菌</em>在原发性巨噬细胞差透
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
细胞内细菌病原体可在细胞质或专门含病原体的空泡（PCVs）复制。到达细胞质，像痢疾杆菌和弗朗西斯novicida细菌需要诱导吞噬体破裂。与此相反， 鼠伤寒沙门氏菌复制在液泡室，被称为沙门氏菌含液泡（SCV）。 沙门氏菌然而某些突变体不能维持SCV完整性并因此释放到胞质溶胶中。胞质与单菌的水平液泡细菌的百分比可以通过差通透性进行测量，也被称为吞噬体的保护测定法。该方法利用洗涤剂毛地黄皂苷的财产选择性结合胆固醇。由于质膜包含比其它细胞膜更胆固醇，毛地黄皂苷可用于选择性地透质膜同时留下细胞内膜完好。简言之，感染后表达的荧光标记蛋白（ 例如 mCherry等等）的病原体，宿主细胞的质膜透化与含有缓冲液短暂孵育毛地黄皂苷。然后将细胞洗涤并孵育一抗（偶联至所选择的荧光团）针对所选择的细菌（ 例如抗沙门氏菌 -FITC），并再次洗涤。如果未标记的细菌时，额外的步骤可以做到的，其中所有的膜透化和所有细菌染色与相应的抗体。以下染色，空泡和细胞内细菌的百分比可以通过FACS或显微镜来量化通过计数单或双阳性事件。在这里，我们提供了实验细节使用这种技术与细菌鼠伤寒沙门氏菌 。该测定的优点在于，相对于其他测定法，它提供了一个量化单bacte的水平河口，如果通过显微镜分析提供胞质和液泡细菌在给定的细胞的精确数量。
Introduction
细胞内细菌病原体复制或者直接在宿主细胞胞质溶胶，或者在专门的液泡区室1。在感染的初始阶段大多数病原体获得通过吞噬作用由专门的细胞（如巨噬细胞），或通过积极推动自身摄取进入非吞噬细胞内化两种。在吞噬细胞，吞噬体通常与溶酶体融合，以形成降解隔室，其中所述吞噬颗粒被消化。专门胞浆菌，如弗朗西斯novicida或志贺氏菌 ，逃避吞噬体降解通过诱导吞噬体的破裂和随后逃逸进入细胞质2,3。这需要毒力相关的机制，如弗朗西斯致病岛（FPI）或痢疾杆菌 T3SS，其中注入效应蛋白促进液泡破裂2-4。宿主细胞细胞质的功能一些保守模式识别受体，通常承认的病原体的存在和诱导先 天免疫信号5。此外，xenophagy，自噬的抗微生物形式能降解该进入细胞质细菌。胞浆菌通常很好地适应生硬或采用不同的策略规避这些反应。例如， 弗朗西斯修改其LPS以避免主机识别和志贺防止自噬招聘使用分泌效应蛋白6,7。
另一种策略逃脱溶酶体降解由模型液泡病原体沙门伤寒采用，此后简称为鼠伤寒沙门氏菌 。 沙门氏菌使用T3SS注入该重塑的初始吞噬体进入细胞内利基效应， 沙门氏菌含液泡（SCV） 8,9。连续操纵宿主的途径是要保持这种空泡招募脂类等营养物质到液泡。事实上， 沙门氏菌的SIFA突变体不能维持液泡稳定，并进入宿主细胞后数小时内细胞质感染后，这导致活化先天免疫途径和自噬招募8。 沙门氏菌的液泡逃逸取决于细胞类型即研究，一些报告显示，在上皮细胞中甚至WT 沙门氏菌能逃脱SCV和hyperreplicate在细胞质10。最近的报告表明，先天免疫检测的病原体空泡也取决于主机的认可和破坏含病原体的空泡（PCVs）11-14能力。
鉴于这两个主机或细菌基因型可影响空泡和细胞内室之间的胞内细菌的分布，有必要进行量化空泡对的数目胞浆菌。因为，在大多数实验设置宿主细胞感染有一个以上的细菌，并随后可以在不同的亚细胞区室怀有几个细菌，一种技术是必要的，它允许量化在单细菌的水平。通透性差（也称为吞噬体保护法）提供了这一决议2,4,10,12。该测定法是基于宿主细胞质膜与洗涤剂毛地黄皂苷，这让液泡膜完好的选择性透和因此允许胞浆菌的抗体的选择性染色。在这里，我们提供了两种协议的使用差分通透性胞浆空泡和鼠伤寒沙门氏菌的定量。这个方法的原理在图1中被描述：骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）感染固定相mCherry表达沙门氏菌 。固定相沙门氏菌需要牛逼ø被使用，因为它们下调的SPI-1 T3SS，其活性将另外由NLRC4炎性被识别，诱导BMDMs 15的快速细胞死亡（pyroptosis）的表达。以下洗涤细胞并用毛地黄皂苷50μg/ ml的1分钟处理过的感染。将细胞立即再次洗涤和温育与耦合到FITC与访问到细胞质标记细菌的抗沙门氏菌抗体。后的附加洗涤步骤细胞裂解和mCherry +（液泡）和FITC + / mCherry +（细胞质）的细菌的百分比是通过FACS测定。我们还报告这种方法，可用于在没有荧光蛋白表达菌株是可用的（ 图2）的适应。附加步骤的FITC标记，其中将细胞固定并完全透后进行了介绍。此后所有的细菌都沾满抗沙门氏菌抗体和相应的二次抗体。 DET挠度然后通过显微镜代替FACS分析进行。
Protocol
Representative Results
Discussion
差透是一个简单而可靠的方法来分析和量化的液泡车厢和细胞质的细菌性病原体的亚细胞分布。相同的测定已被成功地用于与细菌，如弗朗西斯novicida 2,4和志贺氏菌 12。然而，由于许多细胞内病原体改变或修改主机内膜结构，毛地黄皂苷透化的鲁棒性将必须在个体基础上确定。在对于所用可能是必要的病原体或细胞系微调该测定的。该测定不仅限于感染生物学，但也…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢马蒂亚斯S.迪克，罗兰F.德雷尔和塞巴斯蒂安鲁尔讨论。这项工作是由一个SNSF教授PP00P3_139120 / 1和巴塞尔大学的项目赠款ID2153162到PB支持
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
