Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em> Salmonellen</em> In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger können im Cytosol oder in spezialisierten erregerhaltigen Vakuolen (PCV) zu replizieren. Um das Cytosol zu erreichen, Bakterien wie Shigella flexneri und Francis novicida müssen den Bruch der phagosome induzieren. Im Gegensatz dazu repliziert Salmonella typhimurium in einer Vakuole Fach, wie Salmonellen enthaltenden Vakuolen (SCV) bekannt. Jedoch bestimmte Mutanten von Salmonella nicht zu SCV Integrität zu erhalten und somit in das Cytosol freigesetzt. Der Prozentsatz der cytosolischen vs. vakuolären Bakterien auf der Ebene von einzelnen Bakterien können durch differentielle Permeabilisierung gemessen werden, die auch als Phagosomen-Schutzassay bekannt. Der Ansatz nutzt die Eigenschaft des Waschmittels Digitonin, um selektiv binden Cholesterin. Da die Plasmamembran enthält mehr Cholesterin als andere zelluläre Membranen kann Digitonin zur selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran, während die intrazelluläre Membranen werdenintakt. Kurz gesagt, nach einer Infektion mit dem Pathogen ein fluoreszierendes Markerprotein (zB mCherry unter anderem) exprimieren, wird die Plasmamembran der Wirtszellen mit einer kurzen Inkubation in Digitonin enthaltenden Puffer permeabilisiert. Die Zellen werden dann gewaschen und inkubiert mit einem primären Antikörper (mit einem Fluorophor gewählt gekoppelt) gegen das Bakterium der Wahl gerichtet (zB Antisalmon -FITC) und erneut gewaschen. Wenn unmarkierte Bakterien verwendet werden, kann ein zusätzlicher Schritt durchgeführt, in dem alle Membranen werden permeabilisiert und alle Bakterien, die mit einem entsprechenden Antikörper gefärbt. Nach der Färbung kann der Prozentsatz der Vakuole und cytosolische Bakterien durch FACS oder Mikroskopie durch Zählen einfach oder doppelt positive Ereignisse quantifiziert werden. Hier bieten wir experimentelle Details für den Einsatz dieser Technik mit dem Bakterium Salmonella typhimurium. Der Vorteil dieses Tests besteht darin, dass im Gegensatz zu anderen Assays, bietet es eine Quantifizierung auf der Ebene einzelner bacteria stellt die genaue Anzahl der cytosolischen und vakuolären Bakterien in einer gegebenen Zelle, und wenn durch Mikroskopie analysiert.
Introduction
Intrazelluläre bakterielle Pathogene replizieren entweder direkt in der Wirtszelle Zytosol oder in spezialisierten Vakuolen-Kammer 1. Während der Anfangsphase der Infektion am meisten Pathogene erhalten entweder durch Phagozytose durch spezialisierte Zellen (Makrophagen) oder aktiv für ihre eigene Aufnahme in nicht-phagozytische Zellen internalisiert. In Phagozyten, Sicherungen Phagosom normalerweise mit Lysosomen, um einen Abbauraum, in dem die phagozytierten Partikel verdaut werden zu bilden. Fach cytosolischen Bakterien wie Francis novicida oder Shigella flexneri, Flucht phagosomalen Abbau durch Induktion der Bruch der Phagosomen und anschließend in das Cytosol 2,3 entkommen. Dies erfordert virulenzassoziierten Mechanismus wie dem Francis Pathogenitätsinsel (FPI) oder der Shigella flexneri T3SS, die Effektor-Proteine, die Vakuole Bruch 2-4 fördern injiziert. Die Wirtszelle Cytosol Funktioneneine Anzahl von konservierten pattern recognition receptors, die normalerweise erkennen das Vorhandensein von Krankheitserregern und induzieren angeborenen Immunsignal 5. Zusätzlich xenophagy, ein antimikrobielles Form autophagy können Bakterien, die in das Cytosol eintreten verschlechtern. Cytosolische Bakterien sind in der Regel gut geeignet, um stumpf oder Umgehung Antworten mit unterschiedlichen Strategien. Zum Beispiel Francis modifiziert seine LPS zu Hosterkennung zu vermeiden und Shigella verhindert Autophagie Rekrutierung mit sezerniert Effektorproteinen 6,7.
Eine weitere Strategie, um den lysosomalen Abbau entweichen durch den Modell vakuolären Pathogen Salmonella enterica Serovar Typhimurium eingesetzt, danach wie Salmonella typhimurium bezeichnet. Salmonellen benutzt eine T3SS Effektoren, die die anfängliche phagosome in seine intrazelluläre Nische umzu einzuspritzen, Salmonella -enthaltende Vakuole (SCV) 8,9. Kontinuierliche Manipulation von Host Wege istnotwendig, diese Vakuole durch Rekrutierung Lipide und andere Nährstoffe zur Vakuole zu halten. In der Tat, eine Sifa Mutante von Salmonella nicht an vakuolären Stabilität zu gewährleisten, und tritt in das Cytosol der Wirtszellen innerhalb von Stunden nach der Infektion, die Aktivierung der angeborenen Immunwege und Autophagie Rekrutierung 8 Ergebnisse. Vakuolären Entweichen von Salmon hängt vom Zelltyp abhängig, dass Studien ist, und mehrere Berichte haben gezeigt, dass in den Epithelzellen auch WT Salmon die SCV und hyperreplicate im Cytosol 10 entkommen. Jüngste Berichte zeigen, dass die angeborene Immun Nachweis von Vakuolen Erreger hängt auch von der Fähigkeit der Aufnahme zu erkennen und zu destabilisieren erregerhaltigen Vakuolen (PCV) 11-14.
Da sowohl der Host oder Bakterien Genotyp kann die Verteilung der intrazellulären Bakterien zwischen vakuolären und Cytosol zu beeinflussen, ist es notwendig, die Anzahl der vakuolären vs. quantifizierencytosolischen Bakterien. Da in den meisten Versuchsaufbauten Wirtszellen werden mit mehr als einem Bakterium infiziert, und anschließend kann einige Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten Hafen wird eine Technik benötigt, die Quantifizierung auf der Ebene der einzelnen Bakterien ermöglicht. Differential Permeabilisierung (auch als phagosomalen-Schutz-Assay bekannt) bietet diese Entschließung 2,4,10,12. Der Test basiert auf selektive Permeabilisierung der Plasmamembran Wirtszelle mit dem Detergens Digitonin, die vakuoläre Membranen intakt lässt und ermöglicht somit die selektive Anfärbung von zytosolischen Bakterien mit Antikörpern. Im Folgenden sollen zwei Protokolle für die Quantifizierung von cytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium durch Differential Permeabilisierung. Das Prinzip dieses Verfahrens ist in Figur 1 beschrieben: Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) mit stationärer Phase mCherry exprimierenden Salmonellen infiziert. Stationäre Phase Salmonellen brauchen to verwendet werden, weil sie die Expression des SPI-1 T3SS, deren Aktivität die ansonsten von der NLRC4 Inflammasoms erkannt und veran schnellen Zelltod (pyroptosis) des BMDMs 15 herunterregulieren. Nach der Infektion Zellen werden gewaschen und mit 50 ug / ml Digitonin für 1 Minute behandelt. Zellen werden sofort wieder gewaschen und mit Anti-Salmonella-Antikörper an FITC gekoppelt, um Bakterien, die mit Zugang zum Cytosol zu markieren inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt Zellen lysiert und der Prozentsatz der mCherry + (vakuoläre) und FITC + / mCherry + (cytosolische) Bakterien durch FACS bestimmt. Wir zusätzlich eine Anpassung der Methode, die verwendet werden können, wenn keine fluoreszierende Protein exprimierenden Stämme sind (Abbildung 2). Zusätzliche Schritte werden nach der Markierung mit FITC bei denen Zellen fixiert und permeabilisiert vollständig eingeführt. Danach alle Bakterien mit anti Salmonellen-Antikörpern und entsprechenden Sekundärantikörper gefärbt. DetReflexion wird dann durch Mikroskopie anstelle von FACS-Analyse durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Differential Permeabilisierung ist ein einfaches und robustes Verfahren zu analysieren und zu quantifizieren, die subzelluläre Verteilung von bakteriellen Krankheitserregern zwischen vakuolären Fächern und Cytosol. Das gleiche Assay wurde erfolgreich mit Bakterien wie Francis novicida 2,4 und Shigella flexneri 12 verwendet. Da jedoch viele intrazelluläre Pathogen zu verändern oder die Host-endomembrane Strukturen ändern, wird die Robustheit der Digitonin Permeabilisierung ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Mathias S. Dick, Roland F. Dreier und Sebastian Rühl zur Diskussion zu bestätigen. Diese Arbeit wurde von einer SNF-Förderungsprofessuren PP00P3_139120 / 1 und einer Universität Basel Projektzuschuss ID2153162 zu PB unterstützt
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
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