Vacuolar बनाम साइटोसोलिक की मात्रा का ठहराव<em> साल्मोनेला</em> विभेदक Permeabilization द्वारा प्राथमिक मैक्रोफेज में
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों cytosol में या विशेष रोगज़नक़ युक्त रिक्तिकाएं (PCVs) में नकल कर सकते हैं। साइटोसॉल तक पहुंचने के लिए, शिगेला flexneri और Francisella novicida जैसे बैक्टीरिया फेगोसोम का टूटना को प्रेरित करने की आवश्यकता है। इसके विपरीत, साल्मोनेला साल्मोनेला युक्त रिक्तिका (SCV) के रूप में जाना जाता है एक vacuolar डिब्बे में replicates। साल्मोनेला की हालांकि कुछ म्यूटेंट SCV अखंडता बनाए रखने में विफल है और इस तरह साइटोसॉल में जारी किए हैं। एकल बैक्टीरिया के स्तर पर vacuolar बैक्टीरिया बनाम साइटोसोलिक का प्रतिशत भी फेगोसोम-संरक्षण परख के रूप में जाना जाता है, अंतर permeabilization के द्वारा मापा जा सकता है। दृष्टिकोण डिटर्जेंट digitonin की संपत्ति के उपयोग चुनिंदा कोलेस्ट्रॉल बाध्य करने के लिए बनाता है। प्लाज्मा झिल्ली अन्य सेलुलर झिल्ली की तुलना में अधिक कोलेस्ट्रॉल होता है, digitonin इंट्रासेल्युलर झिल्ली जा रही है जबकि चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली permeabilize के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैबरकरार। एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर (दूसरों के बीच जैसे mCherry) व्यक्त रोगज़नक़ के साथ संक्षिप्त, निम्नलिखित संक्रमण में, मेजबान कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली बफर युक्त digitonin में एक छोटी ऊष्मायन के साथ permeabilized है। कोशिकाओं तो धोया और incubated पसंद के जीवाणु के खिलाफ निर्देशित (पसंद का एक फ्लोरोफोरे करने के लिए मिलकर) एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ (जैसे विरोधी साल्मोनेला -FITC) और फिर से धोया जाता है। अगोचर बैक्टीरिया का इस्तेमाल किया जाता है, तो एक अतिरिक्त कदम जिसमें सभी झिल्ली permeabilized कर रहे हैं और सभी बैक्टीरिया एक इसी एंटीबॉडी के साथ दाग, किया जा सकता है। धुंधला के बाद, vacuolar और साइटोसोलिक बैक्टीरिया का प्रतिशत एकल या डबल सकारात्मक घटनाओं की गणना के द्वारा FACS या माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। यहाँ हम जीवाणु साल्मोनेला के साथ इस तकनीक के इस्तेमाल के लिए प्रयोगात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। इस परख का लाभ अन्य परख के विपरीत, यह एक bacte के स्तर पर एक मात्रा का ठहराव प्रदान करता है, वह यह है किरिया, माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया है और अगर किसी दिए गए सेल में साइटोसोलिक और vacuolar बैक्टीरिया की सही संख्या प्रदान करता है।
Introduction
Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों सीधे मेजबान सेल cytosol में, या विशेष vacuolar डिब्बों 1 में या तो दोहराने। संक्रमण के प्रारंभिक चरण के दौरान सबसे रोगजनकों (जैसे मैक्रोफेज के रूप में) या सक्रिय रूप से गैर-phagocytic कोशिकाओं में अपने स्वयं के तेज बढ़ावा देने के द्वारा विशेष कोशिकाओं द्वारा phagocytosis द्वारा या तो भली भाँति मिलता है। Phagocytic कोशिकाओं में, फेगोसोम सामान्य रूप से phagocytosed कणों से पच जाता है जहां एक degradative डिब्बे, के लिए फार्म लाइसोसोम के साथ फ़्यूज़। ऐसे Francisella novicida या शिगेला flexneri के रूप में विशिष्ट साइटोसोलिक बैक्टीरिया, फेगोसोम का टूटना उत्प्रेरण द्वारा phagosomal गिरावट बचने के लिए और बाद में साइटोसॉल 2,3 में भाग जाते हैं। यह एक ऐसी vacuolar टूटना 2-4 का प्रचार करने वाले प्रेरक प्रोटीन injects जो Francisella pathogenicity द्वीप (FPI) या शिगेला flexneri T3SS, के रूप में डाह से जुड़े तंत्र की आवश्यकता है। मेजबान सेल साइटोसॉल सुविधाओंसामान्य रूप से रोगाणुओं की उपस्थिति को समझते हैं और 5 संकेत सहज प्रतिरक्षा को प्रेरित है कि संरक्षित पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स की संख्या। इसके अलावा, xenophagy, भोजी की एक एंटी-माइक्रोबियल फार्म साइटोसॉल दर्ज बैक्टीरिया है कि नीचा कर सकते हैं। साइटोसोलिक बैक्टीरिया आम तौर पर अच्छी तरह से कुंद या अलग अलग रणनीतियों का उपयोग कर इन प्रतिक्रियाओं को नाकाम करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, Francisella मेजबान मान्यता से बचने के लिए अपने एलपीएस को संशोधित और शिगेला स्रावित प्रेरक प्रोटीन 6,7 का उपयोग कर भोजी भर्ती रोकता है।
लाइसोसोमल गिरावट से बचने के लिए एक और रणनीति मॉडल vacuolar रोगज़नक़ साल्मोनेला enterica serovar Typhimurium द्वारा नियोजित है, उसके बाद साल्मोनेला के रूप में भेजा। साल्मोनेला अपने इंट्रासेल्युलर आला में प्रारंभिक फेगोसोम फिर से तैयार है कि प्रभावोत्पादक इंजेक्षन करने के लिए एक T3SS का उपयोग करता है, साल्मोनेला रिक्तिका (SCV) युक्त 8,9। मेजबान रास्ते में से सतत हेरफेर हैआवश्यक रिक्तिका के लिए लिपिड और अन्य पोषक तत्वों की भर्ती करके इस रिक्तिका बनाए रखने के लिए। दरअसल, साल्मोनेला के Sifa उत्परिवर्ती vacuolar स्थिरता बनाए रखने में विफल रहता है, और सहज प्रतिरक्षा रास्ते और भोजी भर्ती 8 की सक्रियता में जो परिणाम के संक्रमण के बाद घंटे के भीतर मेजबान कोशिकाओं के साइटोसॉल, प्रवेश करती है। साल्मोनेला की vacuolar भागने के अध्ययन है कि सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, और कई रिपोर्टों उपकला कोशिकाओं में भी गुम्मट साल्मोनेला साइटोसॉल 10 में SCV और hyperreplicate बच सकते हैं कि पता चला है। हाल ही में रिपोर्ट vacuolar रोगाणुओं की सहज प्रतिरक्षा का पता लगाने को भी समझते हैं और रोगज़नक़ युक्त रिक्तिकाएं (PCVs) 11-14 को अस्थिर करने के लिए मेजबान की क्षमता पर निर्भर करता है कि पता चलता है।
मेजबान या बैक्टीरिया दोनों जीनोटाइप vacuolar और साइटोसोलिक डिब्बे के बीच इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के वितरण को प्रभावित कर सकते हैं कि यह देखते हुए, यह vacuolar बनाम की संख्या यों के लिए आवश्यक हैसाइटोसोलिक बैक्टीरिया। के बाद से सबसे अधिक प्रयोगात्मक setups में मेजबान कोशिकाओं अलग subcellular डिब्बों में कई बैक्टीरिया बंदरगाह कर सकते हैं बाद में एक से अधिक जीवाणु से संक्रमित है, और कर रहे हैं, एक तकनीक एकल बैक्टीरिया के स्तर पर मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि जरूरत है। (यह भी phagosomal संरक्षण परख के रूप में जाना जाता है) विभेदक permeabilization के इस संकल्प 2,4,10,12 प्रदान करता है। परख बरकरार vacuolar झिल्ली जो पत्ते डिटर्जेंट digitonin, साथ मेजबान सेल प्लाज्मा झिल्ली के चुनिंदा permeabilization पर आधारित है और इस प्रकार एंटीबॉडी के साथ साइटोसोलिक बैक्टीरिया के चुनिंदा धुंधला की अनुमति देता है। यहाँ हम अंतर permeabilization का उपयोग कर साइटोसोलिक और vacuolar साल्मोनेला की मात्रा का ठहराव के लिए दो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस पद्धति के सिद्धांत चित्र 1 में वर्णित है: अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) स्थिर चरण साल्मोनेला mCherry व्यक्त से संक्रमित हैं। स्थिर चरण साल्मोनेला टी की जरूरतवे गतिविधि जिसका अन्यथा NLRC4 inflammasome द्वारा मान्यता प्राप्त है और BMDMs 15 का तेजी से कोशिका मृत्यु (pyroptosis) के लिए प्रेरित किया जाएगा SPI-1 T3SS, की अभिव्यक्ति downregulate क्योंकि ओ इस्तेमाल किया जाएगा। कोशिकाओं को धोया और 1 मिनट के लिए digitonin के 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ व्यवहार कर रहे हैं संक्रमण के बाद। कोशिकाओं तुरंत फिर से धोया और साइटोसॉल के उपयोग के साथ बैक्टीरिया चिह्नित करने के लिए FITC के लिए युग्मित विरोधी साल्मोनेला एंटीबॉडी के साथ incubated हैं। कदम कोशिकाओं lysed रहे हैं एक अतिरिक्त धोने और mCherry (+ vacuolar) और FITC / + mCherry (+ साइटोसोलिक) बैक्टीरिया का प्रतिशत के बाद FACS द्वारा निर्धारित किया जाता है। हम भी कोई फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त उपभेदों उपलब्ध (चित्रा 2) कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस विधि के एक अनुकूलन रिपोर्ट। अतिरिक्त चरणों कोशिकाओं तय की और पूरी तरह से permeabilized कर रहे हैं, जिसमें FITC लेबलिंग के बाद पेश कर रहे हैं। इसके बाद सभी बैक्टीरिया विरोधी साल्मोनेला एंटीबॉडी और इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं। डेटection तो बजाय FACS विश्लेषण के माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विभेदक permeabilization के विश्लेषण और vacuolar डिब्बों और साइटोसॉल के बीच बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के subcellular वितरण यों के लिए एक आसान और मजबूत तरीका है। एक ही परख ऐसे Francisella novicida 2,4 और शिगेला flexneri 12 के रूप में बैक्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चर्चा के लिए मैथियास एस डिक, रोलाण्ड एफ Dreier और सेबस्टियन RUHL स्वीकार करना चाहते हैं। यह काम एक SNSF प्रोफेसरशिप PP00P3_139120 / 1 और पंजाब के लिए एक विश्वविद्यालय बासेल की परियोजना अनुदान ID2153162 द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
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