Количественное Цитозольные против вакуолярной<em> Сальмонелла</em> В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
Внутриклеточные бактериальные патогены могут размножаться в цитоплазме или в специализированных патогенов, содержащих вакуолей (PCVs). Чтобы добраться до цитозоль, бактерии, как Shigella Флекснера и Francisella novicida нужно вызвать разрыв фагосомы. В отличие, сальмонелла Typhimurium реплицируется в вакуолярной купе, известный как Salmonella -содержащего вакуоли (SCV). Однако некоторые мутанты Salmonella не поддерживать SCV целостность и, таким образом, выпущен в цитозоль. Процент цитозольного против вакуолярных бактерий на уровне отдельных бактерий может быть измерена дифференциальной проницаемости, также известный как фагосомы-анализ защиты. Подход делает использование имущества моющего средства дигитонина селективно связываться холестерина. Поскольку плазматической мембраны содержит больше холестерина, чем других клеточных мембран, дигитонин может быть использован, чтобы селективно проницаемыми плазматическую мембрану, оставляя внутриклеточных мембранбез изменений. Короче говоря, после инфицирования патогеном, экспрессирующих флуоресцентный белок-маркер (например mCherry среди прочих), плазматической мембраны клеток-хозяев в проницаемыми с короткой инкубации в дигитонин, содержащей буфер. Затем клетки промывали и инкубировали с первичным антителом (соединенный с флуорофора выбора), направленный против бактерии выбора (например, анти-Salmonella -FITC) и снова промывают. Если немаркированных бактерии используется дополнительная стадия может быть сделано, в котором все мембраны проницаемыми и все бактерии окрашивали с соответствующим антителом. После окрашивания, процент вакуолярных и цитоплазмы бактерий может быть количественно FACS или микроскопа путем подсчета одинарные или двойные-положительных событий. Здесь мы предлагаем экспериментальные детали для использования этой техники с бактерией Salmonella Typhimurium. Преимущество такого анализа является то, что, в отличие от других анализа, он обеспечивает количественную на уровне одного bacteРИА, и если анализировали с помощью микроскопии обеспечивает точное число цитозольного и вакуолярных бактерий в данной клетке.
Introduction
Внутриклеточные бактериальные патогены репликации либо непосредственно в цитозоль клетки-хозяина, или в специализированных вакуолярных отсеков 1. Во время начальной стадии инфекции большинство патогенных микроорганизмов получают усвоены либо фагоцитоза специализированных клеток (например, макрофагов), либо активно продвигает свою собственную поглощение в не-фагоцитирующих клеток. В фагоцитирующих клеток, как правило, фагосомы сливается с лизосомы сформировать деструкции отсек, где фагоцитированы частицы переваренной. Специализированный цитозольные бактерии, такие как Francisella novicida или Shigella Флекснера, бежать деградации phagosomal, вызывая разрыв фагосомы и впоследствии бежать в цитозоле 2,3. Это требует вирулентности-ассоциированных механизм таких как Francisella острова патогенности (FPI) или Shigella Флекснера T3SS, который впрыскивает эффекторные белки, которые способствуют вакуолярной разрыв 2-4. Особенности клетка-хозяин цитозольныеКоличество сохраняемых распознающих рецепторов, которые обычно признают наличие возбудителей и вызывают иммунной сигнализации 5. Кроме того, xenophagy, антимикробное форма аутофагии может ухудшить бактерии, которые попадают в цитозоль. Цитозольные бактерии, как правило, хорошо приспособлены к притупить или обойти эти ответы с помощью различных стратегий. Например, Francisella изменяет свои LPS, чтобы избежать признания хоста и шигеллы предотвращает набор аутофагии с помощью секретируемых белков эффекторные 6,7.
Другая стратегия, чтобы избежать деградации лизосомами используется в модели вакуолярный возбудителя Salmonella enterica серовар Typhimurium, после называют Salmonella Typhimurium. Сальмонелла использует T3SS чтобы придать эффекторы, что переделывать первоначальный фагосомы в его внутриклеточной ниши, сальмонеллы -содержащего вакуоли (ПЗК) 8,9. Непрерывная манипуляции принимающих путей являетсянеобходимо сохранить эту вакуоль по вербовке липидов и других питательных веществ в вакуоли. Действительно, SIFA мутант Salmonella не удается поддерживать стабильность вакуолярной, и входит в цитозоле клеток-хозяев в течение нескольких часов после заражения, что приводит к активации врожденного иммунитета путей и аутофагии набора 8. Вакуолярной побег Salmonella варьируется в зависимости от типа клеток, что является исследования, и несколько отчетов показали, что в эпителиальных клетках даже БТ Сальмонелла может избежать SCV и hyperreplicate в цитозоле 10. Последние отчеты показывают, что врожденная иммунная обнаружения патогенов вакуолярных также зависит от способности хозяина, чтобы признать и дестабилизировать патогенов, содержащий вакуоли (PCVs) 11-14.
Учитывая, что оба хоста или бактерии генотип может влиять на распределение внутриклеточных бактерий между вакуолярную и цитозольной отсека, необходимо определить число вакуоли VS.цитозольные бактерии. Так, в большинстве экспериментальных установок клетки-хозяева инфицированы более чем одной бактерии, и в дальнейшем может питать несколько бактерий в различных субклеточных отсеков, метод необходим, что позволяет количественной на уровне отдельных бактерий. Дифференциальный пермеабилизации (также известный как защита phagosomal анализа) обеспечивает эту резолюцию 2,4,10,12. Анализ основан на селективной проницаемости мембраны клетки-хозяина плазмы с моющим средством дигитонин, что оставляет нетронутыми вакуоли мембраны и, таким образом, позволяет избирательно окрашивание цитоплазмы бактерии с антителами. Здесь мы предлагаем два протокола для количественного определения цитозольного и вакуолярной Salmonella Typhimurium, используя дифференциальный пермеабилизации. Принцип этого метода описан в рисунке 1: костный мозг, полученные макрофаги (BMDMs) заражены стационарной фазы mCherry-выражения сальмонеллы. Стационарная фаза сальмонеллы нужно тО быть использованы, потому что они подавляют экспрессию SPI-1 T3SS, чья деятельность в противном случае будут признаны инфламмасома NLRC4 и вызывают быструю смерть клеток (pyroptosis) в BMDMs 15. После инфекции клетки промывают и обрабатывают 50 мкг / мл дигитонина в течение 1 минуты. Клетки снова промывают сразу и инкубировали с анти-антител сальмонеллы, соединенных с FITC, чтобы отметить бактерии с доступом в цитозоль. После дополнительного этапа промывки клетки лизируют и процент mCherry + (вакуоли) и FITC + / + mCherry (цитозольного) бактерий определяется FACS. Мы также сообщают об адаптации этого метода, которые могут быть использованы, если нет флуоресцентные штаммы, экспрессирующие белок не доступны (рисунок 2). Дополнительные шаги вводятся после FITC маркировки, в котором клетки фиксированной и полностью проницаемыми. После этого все бактерии окрашивали анти Salmonella антител и соответствующих вторичных антител. Detотражения затем сделать с помощью микроскопии вместо анализа FACS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дифференциальный пермеабилизации это легко и надежный метод для анализа и количественной оценки субклеточную распределение бактериальных патогенов между вакуолярных отсеков и цитозоле. Анализ же успешно используется такими бактериями, как Francisella novicida 2,4 и шигеллы Флекс…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Mathias S. Дик, Roland Ф. Дрейер и Себастьян Рул для обсуждения. Эта работа была поддержана SNSF профессуру PP00P3_139120 / 1 и Университета Базеля грантового проекта ID2153162 к ПБ
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
