Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em> Salmonella</em> Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
Hücre içi bakteriyel patojenler sitosolde veya özel patojen içeren vakuol (PCVS) 'de çoğaltabilirsiniz. Sitoplazmada ulaşmak için, Shigella flexneri'ye ve Francisella novicida gibi bakteriler fagozomun rüptürü ikna etmek gerekir. Bunun aksine, Salmonella typhimurium, Salmonella-ihtiva-eden vakuol (SCV) olarak bilinen bir vakuolar bölmesi içinde çoğaltılır. Salmonella Ancak bazı mutantlar SCV bütünlüğünü korumak için başarısız ve böylece sitozolüne salınır. Tek bir bakteri seviyesine vakuolar bakteri genel sitosolik yüzdesi da fagosom-koruma deneyi olarak bilinen, ayırıcı permeabilization ile ölçülebilir. yaklaşım deterjan digitonin mülkiyet kullanımı seçici kolesterol bağlamak için yapar. Plazma membranı diğer hücre membranları daha fazla kolesterol içerdiği, Digitonin hücre içi zarlar bırakırken seçici plazma membran geçirgenliği kullanılabilirbozulmamış. Floresan markör proteinin (diğerleri arasında, örneğin MCherry) ifade patojen ile kısa süreli, enfeksiyona, konakçı hücrelerin plazma membran tampon içeren digitonin kısa bir kuluçkalama permeabilize edilmiştir. Hücreler daha sonra yıkandı ve inkübe tercih bakteriye karşı yönlendirilmiş (seçim bir flüorofora bağlı), bir primer antikor ile (örneğin, anti-Salmonella -FITC) ile tekrar yıkanır. İşaretlenmemiş bakteriler kullanıldığı takdirde, ilave bir aşama olduğu tüm zarlar geçirgen ve tüm bakteri karşılık gelen bir antikor ile boyandı, yapılabilir. Boyama işleminin ardından, vakuolar ve sitosolik bakteri oranı, tek veya çift-pozitif olaylar sayarak, FACS ya da mikroskop ile tayin edilebilir. Burada bakteri Salmonella typhimurium, bu tekniğin kullanımı için deneysel ayrıntıları sunmaktadır. Bu testin bir avantajı, diğer deneyde tersine, tekli bacte düzeyinde bir ölçümü sağlar, kiRia, mikroskopi ile analiz edildi ve eğer belirli bir hücrede sitosolik ve vakuolar bakterilerin tam sayısını içerir.
Introduction
Hücre içi bakteriyel patojenler doğrudan konak hücre sitoplazmada veya uzman vakuoler bölmelerde 1 ya çoğaltmak. Enfeksiyonun başlangıç aşamasında en patojenler (örneğin histiositler gibi) ya da aktif bir fagositik olmayan hücrelere kendi alımını teşvik ederek özel hücreler tarafından fagositoz yoluyla internalize olsun. Fagositik hücrelerde, fagosom normalde fagosite parçacıklar sindirilir bir parçalayıcı bölme oluşturmak için lizozomlar ile sigortalar. Böyle Francisella novicida veya Shigella flexneri gibi özel sitozolik bakteriler, fagozomun rüptürü uyararak phagosomal bozulmasını kaçmak ve daha sonra sitozol 2,3 kaçmasına. Bu tür vakuoler rüptürü 2-4 teşvik efektör proteinleri enjekte Francisella Patojenite Adası (FPI) ya da Shigella flexneri T3SS gibi virülans ilişkili mekanizması gerektirir. konakçı hücre sitosol özellikleriNormalde patojenlerin varlığı tanımak ve 5 sinyal doğuştan gelen bağışıklık neden korunmuş örüntü tanıma reseptörleri bir dizi. Buna ek olarak, xenophagy, otofaji bir anti-mikrobiyal formu sitoplazmada girmek bakteri düşürebilir. Sitozolik bakteriler normalde iyi künt veya farklı stratejiler kullanarak bu yanıtları aşmak için uyarlanmıştır. Örneğin, Francisella konak tanıma önlemek için kendi LPS değiştirir ve Shigella salgılanan proteinler efektör 6,7 kullanarak otofaji işe engeller.
Lizozomal bozulması kaçmak için bir başka strateji modeli vaküoler patojen Salmonella serovar Typhimurium'da tarafından istihdam edilmektedir, bundan sonra Salmonella typhimurium olarak anılacaktır. Salmonella hücre içi niş içine ilk phagosome pişmanlık efektörleri enjekte etmek için bir T3SS kullanır Salmonella vakuol (SCV) içeren 8,9. Ev sahibi yollarının sürekli manipülasyon olduğunuGerekli vaküole lipidler ve diğer besin alımı yoluyla bu çarpıtma korumak için. Gerçekten de, Salmonella şifa mutant vakuolar stabilitesini korumak için başarısız olur ve doğuştan gelen bağışıklık yolları ve Otofaji işe 8 aktivasyonu ile sonuçlanır enfeksiyondan sonra birkaç saat içinde konakçı hücrelerin sitosol girer. Salmonella koful çıkış çalışmaları olduğu hücre tipine bağlı olarak değişir, ve çeşitli epitelial hücrelerinde daha WT Salmonella sitozol 10 SCV ve hyperreplicate kaçabilir göstermiştir. Son raporlar vakuoler patojenlerin doğuştan gelen bağışıklık tespiti de tanımak ve patojen içeren vakuoller (PCVS) 11-14 istikrarsızlaştırmak için konağın yeteneğine bağlıdır göstermektedir.
Ev sahibi ya da bakteri hem genotip vaküoler ve sitozolik bölme arasındaki hücre içi bakteri dağılımını etkileyebilir göz önüne alındığında, bu vaküoler vs sayısını ölçmek için gerekli olansitosolik bakteri. Bu yana, en deney düzeneğinde konakçı hücreler, farklı hücre içi bölmelerde bir çok bakteri barındırabilir, daha sonra fazla bir bakteri ile enfekte edildi ve edilmektedir, bir teknik, tek bakteri seviyesine ölçümü sağlar ihtiyaç vardır. (Ayrıca phagosomal koruma deneyi olarak da bilinir) Diferansiyel permeabilization bu çözünürlük 2,4,10,12 sağlar. deney sağlam vakuolar membranlar bırakır deterjan digitonin ile konakçı hücre, plazma zarının seçici geçirgenliği göre ve böylece antikorlar ile sitosolik bakteri seçici boyanmasını izin verir. Burada diferansiyel permeabilization kullanarak sitozolik ve vakuolar Salmonella typhimurium ölçümü için iki protokol sağlar. Bu yöntemin prensibi, Şekil 1 'de tarif edilmektedir: Kemik iliği türevli makrofajlar (BMDMs) durağan faz Salmonella MCherry-ifade ile enfekte edilir. Sabit faz Salmonella t gerekOnlar faaliyet aksi NLRC4 inflammasome tarafından tanınan ve BMDMs 15 hızlı hücre ölümünü (pyroptosis) neden olacağını SPI-1 T3SS, ifade downregulate çünkü o kullanılır. Hücreler yıkandı ve 1 dakika için digitonin 50 ug / ml ile muamele edilir enfeksiyonu takiben. Hücreler hemen tekrar yıkandı ve sitoplazmada erişimi olan bakteri işaretlemek için FITC bağlanmış anti-Salmonella antikorlar ile inkübe edilir. Adım hücreler parçalanır ek yıkama ve MCherry + (vakuolar) ve FITC + / MCherry + (sitosolik) bakteri yüzdesi sonra FACS ile tespit edilir. Ayrıca herhangi bir floresan proteini eksprese eden suşlar mevcuttur (Şekil 2) ise kullanılabilecek bu yöntemin bir uyarlamasını sunulmuştur. Ek adımlar hücreler, sabit ve tamamıyla geçirgen olan FITC etiketleme sonra katılır. Bundan sonra, tüm bakteriler anti-Salmonella antikorlar ve buna tekabül eden ikincil antikor ile boyandı. Detection daha sonra yerine FACS analizinin mikroskobu ile yapılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferansiyel permeabilization analiz ve vakuolar bölmeleri ve sitoplazmada arasındaki bakteriyel patojenlerin hücre içi dağıtım ölçmek için kolay ve sağlam bir yöntemdir. Aynı deney gibi Francisella novicida 2,4 ve Shigella flexneri 12 olarak bakteri başarıyla kullanılmaktadır. Birçok hücre içi patojen değiştirebilir veya ana bilgisayar hücreiçi yapılarını değiştirmek olduğundan Ancak, digitonin permeabilization sağlamlığı bireysel olarak belirlen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz tartışma için Mathias S. Dick, Roland F. Dreier ve Sebastian Ruhl kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, bir SNSF Profesörlük PP00P3_139120 / 1 ve PB Bir Üniversite Basel proje hibe ID2153162 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
