العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي
Summary
The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.
Abstract
The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.
Introduction
البطانة الوعائية ليست سوى طبقة الحاجز الذي يفصل بين الدم والأنسجة، وأنها تعتبر الغدة الصماء الواسعة التي تمتد فوق الشجرة الوعائية كامل مع مساحة 400 متر مربع 1. رفاه البطانة ضروري لتوازن الأوعية الدموية. تشارك البطانة المختلة وظيفيا في مختلف اضطرابات القلب والأوعية الدموية، بما في ذلك تصلب الشرايين، والأوعية الدموية والإصابات نقص التروية / ضخه، الخ 2-4. حتى الآن، والآليات الخلوية والجزيئية المحددة المعنية في إعدادات المرض هذه ليست مفهومة جيدا نظرا لطبيعة التشريحية تنتشر من البطانة.
الفأر هو نموذجا هاما للبحوث لتقنيات التلاعب الوراثية هي الأكثر نموا في الفئران مما كانت عليه في أي نوع من الثدييات الأخرى. ومع ذلك، يعتبر عزل الخلايا البطانية الأورطي الفئران الأولية صعبة للغاية بسبب صغر حجم الشريان الأورطي يجعل enzymatجيم الهضم من البطانة غير عملي. ذكرت بعض الإجراءات لعزل وتنقية ECS تتطلب 5-7.
والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام طريقة بسيطة لعزل وتوسيع الخلايا البطانية من الشريان الأورطي الماوس دون استخدام أي معدات خاصة. في هذا البروتوكول، هو قطع الشريان الأورطي المعزولة حديثا الى شرائح صغيرة والمصنفة على مصفوفة مع البطانة أسفل للسماح تنتشر البطانية. بعد إزالة شرائح، يتم توسيع الخلايا البطانية في متوسطة يفضل البطانة ونحن على استعداد لإجراء التجارب بعد يومين أو ثلاثة مقاطع. مزايا الطريقة الموصوفة هي: 1) ارتفاع عدد كبير من الخلايا البطانية يتم حصادها من الشريان الأورطي واحد؛ 2) وبقاء الخلية الحفاظ عليها بشكل جيد. و3) لا تحتاج إلى معدات خاصة أو تقنية. ويوفر وسيلة فعالة لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية محددة في الفيزيولوجيا المرضية الخلايا البطانية. بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في دراسة العلاقات العامةimary الخلايا البطانية مثقف من أي الجينات الفئران خروج المغلوب، الجينات تدق في الفئران، أو نموذج المرض الفئران، وهذا البروتوكول هو مفيد جدا وسهلة لممارسة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتوضح هذه الدراسة طريقة بسيطة لعزل والبطانية الثقافة خلايا من الشريان الأورطي الماوس دون أي معدات خاصة. وأشار تلطيخ المناعي أن غالبية الخلايا كانت الخلايا البطانية بعد مرور الثاني. ويشار إلى أن خلايا في الثانية لمرور الثالث هي مناسبة لفي التجارب المختبرية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 and the National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). We thank Roberto Mendez from Wayne State University for assisting in the preparation of the manuscript.
Materials
| 4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664). |
| Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023). |
| Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149). |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100μg/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]). |
| Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231). |
| Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]). |
| Gelatin (100‑200 μg/cm2, Sigma, #G1393). |
| 1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484), FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006), Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372). |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005) |
| One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222). |
| 100mm Peri dishes (Fisher Scientific, #07-202-516). |
| Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B). |
| T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076) |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc) |
| Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp |
| Centrifuge machine. |
| Inverted phase-contrast microscope. |
| inverted fluorescence microscope. |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
