T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية
Summary
هنا يرد بروتوكول لقياس التقاط البكتيريا عن طريق خلايا CD4 + T التي تحدث أثناء تقديم المستضد عبر transinfection من الخلايا الجذعية المصابة مسبقا (DC). وتبين لنا كيفية تنفيذ الخطوات الضرورية: عزل الخلايا الأولية، وإصابة DC، DC / T تشكيل المترافقة الخلية، وقياس البكتيرية ترنسفكأيشن الخلايا التائية.
Abstract
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Introduction
عندما يصيب الممرض مضيفه، عادة ما يكون هناك تفعيل الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، اللازمة لإزالة البكتيريا. المناعة الفطرية هي خط الدفاع الأول الذي يمنع معظم الالتهابات. المناعة الفطرية تميز في العناصر المحددة الطريقة التي يتم الحفاظ عليها في مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة (أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، PAMPS) 1. آليات المناعة الفطرية وتشمل الحواجز المادية مثل الجلد، والحواجز المواد الكيميائية (الببتيدات المضادة للميكروبات، الليزوزيم) والكريات البيض الفطرية، والتي تشمل البالعات (الضامة، العدلات، والخلايا الجذعية)، الخلايا البدينة، الحمضات، الخلايا القاعدية، والخلايا القاتلة الطبيعية 2. هذه الخلايا تحديد وإزالة مسببات الأمراض، إما عن طريق مهاجمتهم من خلال الاتصال أو عن طريق البلعمة، والذي يتضمن العوامل المسببة للأمراض التي تجتاح والقتل. هذا النظام لا يسمح دفاع مدى الحياة، على النقيض من الحصانة على التكيف، والتي تمنح الذاكرة المناعية ضد صathogens. الجهاز المناعي التكيفي هو خط الدفاع الثاني وغير قادرين على التعرف والرد على مستضدات معينة من الجراثيم المتعددة والمواد غير الميكروبية 3. المكونات الرئيسية للجهاز المناعي التكيفي هي الخلايا الليمفاوية، والتي تشمل خلايا B و T. وتشارك خلايا B في الاستجابة الخلطية، إفراز أجسام مضادة ضد مسببات الأمراض أو البروتينات الخارجية. ومع ذلك، وخلايا T تمثل مناعة خلوية، تحوير الاستجابة المناعية مع إفراز السيتوكينات او قتل الخلايا المصابة الممرض 4.
مستضد الخلايا تقديم (ناقلات الجنود المدرعة) بما في ذلك الخلايا الجذعية أو الضامة، مكونات نظام المناعة الفطري، يمكن التعرف على مسببات الأمراض يبلعم ومكونات عملية البكتيرية إلى المستضدات، والتي يتم تقديمها في سطح الخلية التي كتبها مجمع على التوافق النسيجي الكبرى (MHC) 5-7. بعد ناقلات الجنود المدرعة وphagocytized مسببات الأمراض، وعادة ما تهاجر إلى الغدد الليمفاوية تجفيف، حيث تتفاعل مع Tالخلايا. يمكن أن الخلايا الليمفاوية T تعترف مجمعات محددة الببتيد MHC بواسطة مستقبلات الخلايا T بهم. المشبك المناعي (IS) يحدث في واجهة بين APC-تحميل مستضد والخلايا اللمفاوية خلال تقديم المستضد 8،9. يمكن لبعض البكتيريا البقاء على قيد الحياة البلعمة وتنشر بشكل منتظم داخل ناقلات الجنود المدرعة. في هذا الرأي، ناقلات الجنود المدرعة المصابة بمثابة خزانات البكتيرية أو "أحصنة طروادة" التي تسهل انتشار بكتيريا 10. في اتصال حميم بين ناقلات الجنود المدرعة والخلايا الليمفاوية التي تحدث أثناء تشكيل هي وظيفة أيضا كمنصة لتبادل جزء من الأغشية، والمادة الوراثية وexosomes ويمكن خطف لبعض الفيروسات لتصيب خلايا T؛ وهذا ما يسمى عملية transinfection 11-13.
بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمراض (الليستريا المستوحدة، السالمونيلا الملهبة والشيجلا الفلكسنرية) قادرة على غزو الخلايا اللمفية تي في الجسم الحي وتعديل سلوكهم 14-16. لديناوصف مؤخرا أن الخلايا اللمفية تي هي أيضا قادرة على التقاط البكتيريا عن طريق transinfection من الخلايا الجذعية المصابة سابقا (DCS) أثناء تقديم المستضد 16. T خلية التقاط البكتيريا عن طريق transinfection جدا أكثر فعالية (1،000-4،000x) من العدوى المباشرة. T القبض على خلايا البكتيريا الممرضة وغير الممرض تشير من transinfection هو عملية يقودها خلايا T. لافت للنظر، transinfected T (تيط) خلايا قتل البكتيريا بسرعة القبض وفعلت ذلك أكثر كفاءة من البالعات المهنية 16. هذه النتائج، التي كسر عقيدة علم المناعة، وتبين أن خلايا المناعة التكيفية يمكن أن تؤدي المهام التي كانت حصرية من المفترض أن الحصانة الفطرية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أن الخلايا تيط تفرز كميات كبيرة من السيتوكينات الموالية للالتهابات وتحمي من العدوى البكتيرية في الجسم الحي.
هنا نقدم البروتوكولات المختلفة المستخدمة لدراسة عملية transinfection البكتيرية فينموذج الفأر. ويستند هذا النموذج على استخدام خلايا CD4 + T من الفئران المعدلة وراثيا OTII والتي تحمل محددة TCR لالببتيد 323-339 من OVA (OVAp) في سياق I-أب 17 التي تتفاعل بشكل خاص مع العظام بكتيريا المصابة كوسا- البلدان النامية المشتقة (BMDCs) 18،19 محملة OVAp، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعي مستقرة.
T خلية transinfection يمكن تصور وتتبع باستخدام المجهر مضان. بالإضافة إلى ذلك، التدفق الخلوي يمكن استخدامها للكشف عن الخلايا المصابة من خلال الاستفادة من مضان المنبعثة من البكتيريا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) 16،20. وعلاوة على ذلك، T خلية transinfection يمكن قياس باتباع نهج أكثر حساسية، وفحص بقاء الجنتاميسين التي تسمح بقياس عدد كبير من الأحداث. جنتاميسين مضاد حيوي لا يمكن اختراق الخلايا حقيقية النواة. ولذلك، باستخدام هذه المضادات الحيوية يسمح التفريق بين البكتيريا داخل الخلايا التي نجت إضافة الاب المضادات الحيويةتلك الخلية أوم الذين قتلوا 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلايا T أو T الليمفاوية هي نوع من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في مناعة خلوية وتنتمي إلى الاستجابة المناعية التكيفية 26. خلايا T هي صهر لإصابتها في المختبر ولكن تشير بعض التقارير أنها يمكن أن تصاب في الجسم الحي 14،15. الاتصالات الحميمة من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
Materials
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. . Molecular biology of the cell. , (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. . Medical Phisiology. , (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D’Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., Coligan, J. E. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
