टी कोशिकाओं वृक्ष के समान कोशिकाओं से Transinfection द्वारा बैक्टीरिया पर कब्जा
Summary
यहाँ एक प्रोटोकॉल पूर्व संक्रमित वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) से transinfection के माध्यम से प्रतिजन प्रस्तुति के दौरान होता है, जो सीडी 4+ टी कोशिकाओं द्वारा बैक्टीरियल कब्जा को मापने के लिए प्रस्तुत किया है। प्राथमिक कोशिकाओं, डीसी, डीसी / टी सेल संयुग्म गठन के संक्रमण, और बैक्टीरियल टी सेल अभिकर्मक के माप का अलगाव: हम आवश्यक कदम प्रदर्शन करने के लिए कैसे दिखा।
Abstract
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Introduction
एक रोगज़नक़ अपने मेजबान को संक्रमित करते हैं, आमतौर पर बैक्टीरियल मंजूरी के लिए आवश्यक सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक सक्रियण है। सहज उन्मुक्ति सबसे अधिक संक्रमण से बचाता है कि रक्षा की पहली पंक्ति है। सहज उन्मुक्ति सूक्ष्मजीवों के व्यापक समूहों के बीच संरक्षित कर रहे हैं कि एक सटीक तरीका तत्वों (रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न, PAMPs) 1 में भेद। सहज उन्मुक्ति के तंत्र फ़ैगोसाइट (मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, और वृक्ष के समान कोशिकाओं), मस्तूल कोशिकाओं, इयोस्नोफिल्स, बेसोफिल, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं में शामिल हैं जो शारीरिक ऐसी त्वचा के रूप में बाधाओं, रसायन बाधाओं (रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स, लाइसोज़ाइम) और जन्मजात ल्यूकोसाइट्स शामिल 2। इन कोशिकाओं को संपर्क के माध्यम से या रोगज़नक़ छा और हत्या भी शामिल है जो phagocytosis, के माध्यम से उन पर हमला करके या तो पहचान करने और रोगज़नक़ों को समाप्त। इस प्रणाली के पी के खिलाफ प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति प्रदान जो अनुकूली प्रतिरक्षा, के विपरीत, आजीवन रक्षा की अनुमति नहीं हैathogens। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली रक्षा की दूसरी पंक्ति है और समझते हैं और कई सूक्ष्म जीवाणु और गैर-माइक्रोबियल पदार्थों 3 के विशिष्ट एंटीजन करने के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम है। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के मुख्य घटक बी और टी कोशिकाओं में शामिल हैं जो लिम्फोसाइट्स, कर रहे हैं। बी कोशिकाओं रोगजनकों या exogenous प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी स्रावित, त्रिदोषन प्रतिक्रिया में शामिल कर रहे हैं। हालांकि, टी कोशिकाओं साइटोकिन्स स्राव या हत्या रोगज़नक़ संक्रमित कोशिकाओं 4 के साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियमन, सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा में प्रतिनिधित्व करते हैं।
परिसर प्रमुख उतक अनुरूपता (एमएचसी) 5-7 से कोशिका की सतह पर प्रस्तुत कर रहे हैं, जो एंटीजन, में phagocytose रोगज़नक़ों और प्रक्रिया जीवाणु घटकों को पहचान सकते हैं वृक्ष के समान कोशिकाओं या मैक्रोफेज, सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के घटक, सहित प्रतिजन कोशिकाओं (APCs)। APCs रोगजनकों phagocytized करने के बाद, वे आम तौर पर वे टी के साथ बातचीत जहां निकासी लिम्फ नोड्स, की ओर पलायनकोशिकाओं। टी lymphocytes उनकी टी सेल रिसेप्टर्स द्वारा विशिष्ट पेप्टाइड-एमएचसी परिसरों को पहचान सकते हैं। प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन (है) प्रतिजन प्रस्तुति 8,9 दौरान एक प्रतिजन से भरी हुई एपीसी और एक लिम्फोसाइट के बीच इंटरफेस में होता है। कुछ बैक्टीरिया phagocytosis जीवित है और APCs के भीतर व्यवस्थित का प्रसार कर सकते हैं। इस दृश्य में, संक्रमित APCs बैक्टीरियल जलाशयों या बैक्टीरियल प्रसार 10 की सुविधा है कि "ट्रोजन घोड़ों" के रूप में काम करते हैं। APCs और आईएस गठन के दौरान उस जगह ले लिम्फोसाइटों के बीच घनिष्ठ संपर्क भी झिल्ली, आनुवंशिक सामग्री और exosomes के हिस्से के आदान-प्रदान के लिए एक मंच के रूप में कार्य और टी कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए कुछ वायरस के लिए अपहरण किया जा सकता है; इस प्रक्रिया transinfection 11-13 कहा जाता है।
कुछ रोगजनक बैक्टीरिया (लिस्टेरिया monocytogenes, साल्मोनेला enterica और शिगेला flexneri) विवो में टी lymphocytes आक्रमण और उनके व्यवहार को 14-16 संशोधित करने के लिए सक्षम हैं। हमारे पास हैहाल ही में टी lymphocytes भी प्रतिजन प्रस्तुति 16 के दौरान पहले से संक्रमित वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) से transinfection द्वारा बैक्टीरिया कब्जा करने में सक्षम हैं कि वर्णन किया। टी सेल प्रत्यक्ष संक्रमण से (1,000-4,000x) निहायत अधिक प्रभावी transinfection द्वारा बैक्टीरियल कब्जा। Transinfection से दर्शाते हुए टी कोशिकाओं पर कब्जा पैथोजन तथा गैर-रोगजनक बैक्टीरिया टी कोशिकाओं द्वारा संचालित एक प्रक्रिया है। आश्चर्यजनक, कोशिकाओं के तेजी से कब्जा कर लिया बैक्टीरिया को मार डाला और पेशेवर फ़ैगोसाइट 16 से इतनी अधिक कुशलता से किया था टी (चूची) transinfected। इम्यूनोलॉजी की हठधर्मिता तोड़ने जो ये परिणाम, अनुकूली प्रतिरक्षा की कोशिकाओं को सहज उन्मुक्ति का माना जाता है कि अनन्य थे कि कार्य कर सकते हैं कि पता चलता है। इसके अलावा, हम तैसा कोशिकाओं समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की बड़ी मात्रा में स्रावित और इन विवो में बैक्टीरिया के संक्रमण से बचाने के दिखाया।
यहाँ हम में बैक्टीरिया transinfection प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल अलग प्रोटोकॉल पेशएक माउस मॉडल। यह मॉडल जीवाणु से संक्रमित हड्डी के साथ विशेष बातचीत कि मैं अटल बिहारी 17 के संदर्भ में ओवीए (OVAp) की पेप्टाइड 323-339 के लिए एक TCR विशिष्ट सहन जो ट्रांसजेनिक OTII चूहों से सीडी 4+ टी कोशिकाओं के उपयोग पर आधारित है marrow- स्थिर प्रतिरक्षा synapses के गठन OVAp के साथ भरी हुई व्युत्पन्न DCs (BMDCs) 18,19,।
टी सेल transinfection कल्पना और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लगाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रवाह cytometry हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) 16,20 व्यक्त बैक्टीरिया द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का लाभ लेने से संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, टी सेल transinfection एक और अधिक संवेदनशील दृष्टिकोण, घटनाओं की एक बड़ी संख्या की माप की अनुमति देता है कि जेंटामाइसिन अस्तित्व परख द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। जेंटामाइसिन कोशिकाओं घुसना नहीं कर सकते हैं कि एक एंटीबायोटिक है। इसलिए, इस एंटीबायोटिक का उपयोग कर एंटीबायोटिक इसके अलावा मंगलवार बच गया है कि इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के भेदभाव की अनुमति देता है21 मारे गए थे कि ओम बाह्य वाले।
Protocol
Representative Results
Discussion
टी कोशिकाओं या टी lymphocytes अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से 26 सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और है कि ल्यूकोसाइट्स का एक प्रकार है। टी कोशिकाओं इन विट्रो में संक्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
Materials
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |
References
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