Т-клеток Захват бактерий Transinfection от дендритных клеток
Summary
Вот протокол представлен для измерения бактериальной захвата CD4 + Т-клеток, которые произошли во время презентации антигена через transinfection из предварительно зараженных дендритных клеток (ДК). Мы покажем, как выполнить необходимые шаги: изоляция первичных клеток, инфекции формирования сопряженной клеток DC, DC / T, и измерения бактериальной трансфекции Т-клеток.
Abstract
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Introduction
Если патоген поражает своего хозяина, обычно активация врожденных и адаптивных реакций иммунной, необходимых для бактериальной очистки. Врожденный иммунитет является первой линией обороны, что не позволяет большинству инфекций. Врожденный иммунитет отличать через точный способ элементов, которые сохраняются среди широких групп микроорганизмов (патоген-ассоциированных молекулярных моделей, PAMPs) 1. Механизмы врожденного иммунитета включают в себя физические барьеры, такие как кожа, химикаты барьеры (антимикробные пептиды, лизоцим) и врожденные лейкоциты, которые включают фагоциты (макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки), тучные клетки, эозинофилы, базофилы и естественных клеток-киллеров 2. Эти клетки выявить и устранить болезнетворные микроорганизмы, либо, нападая на них при контакте или через фагоцитоза, который включает в себя возбудитель охватившим и убийство. Эта система не позволяет на протяжении всей жизни оборону, в отличие от адаптивного иммунитета, которые придают иммунологическую память против рathogens. Адаптивная иммунная система является второй линией обороны и способна распознавать и реагировать на специфические антигены множественной микробной и не микробные-веществ 3. Основными компонентами адаптивной иммунной системы являются лимфоциты, которые включают В- и Т-клеток. В-клетки участвуют в гуморального ответа, секретирующие антитела против патогенов или экзогенных белков. Однако Т-клетки представляют собой клеточный иммунитет, модуляции иммунного ответа цитокинами секреции или убивают патогенов клеток, инфицированных 4.
Антиген-представляющих клеток (БТР), включая дендритные клетки или макрофаги, составляющих иммунной системы, могут признать фагоцитировать патогенов и процесса бактериальных компонентов в антигенов, которые представлены на поверхности клеток в главный комплекс гистосовместимости (МНС). 5-7 После БТР уже фагоцитируются патогенов, они, как правило мигрируют в лимфатические узлы слива, где они взаимодействуют с Тклеток. Т-лимфоциты могут распознавать специфические комплексы пептид-МНС их Т-клеточных рецепторов. Иммунная синапса (ИС) имеет место на границе раздела между антиген-АПК и загружен лимфоцита в течение презентации антигена 8,9. Некоторые бактерии могут выжить фагоцитоз и распространять систематически в течение БТР. С этой точки зрения, зараженные БТР служить бактериальных водоемов или "троянских коней", которые облегчают распространение бактерий 10. Интимная контакт между БТР-лимфоцитов и, которые имеют место в ходе формирования также функционировать в качестве платформы для обмена части мембраны, генетический материал и экзосом и может быть угнан для некоторых вирусов заражают Т-клеток; Этот процесс называется transinfection 11-13.
Некоторые патогенные бактерии (Listeria моноцитогенес, сальмонеллы enterica и шигеллы Флекснера) могут вторгнуться в Т-лимфоциты в естественных условиях и изменить свое поведение 14-16. У нас естьНедавно описано, что Т-лимфоциты также могут захватывать бактерии от transinfection от ранее инфицированных дендритных клеток (DC) в течение 16 презентации антигена. Т-клеток бактериальной захват transinfection чрезвычайно более эффективной (1,000-4,000x), чем прямые инфекций. Т клетки патогена захват и непатогену бактерии с указанием, чем transinfection является процесс, движимый Т-клеток. Поразительно, transinfected Т (Тит) клетки быстро убили захваченных бактерий и сделал так более эффективно, чем профессиональных фагоцитов 16. Эти результаты, которые нарушают догмы иммунологии, показывают, что клетки адаптивного иммунитета может выполнять функции, которые были якобы эксклюзивные из врожденного иммунитета. Кроме того, мы показали, что Тит клетки секретируют большое количество провоспалительных цитокинов и защищают от бактериальных инфекций в естественных условиях.
Здесь мы представляем различные протоколы, используемые для изучения процесса бактериальной transinfection вмодель мыши. Эта модель основана на использовании CD4 + Т-клеток из трансгенных мышей OTII, которые несут специфического TCR для пептида 323-339 яйцеклеток (OVAp) в контексте I-Ab 17, которые взаимодействуют с бактериальной специально-инфицированной кости marrow- полученные ДК (BMDCs) 18,19 загруженные OVAp, образуя устойчивые иммунные синапсов.
Т-клеток transinfection могут быть визуализированы и отслеживаются с помощью флуоресцентной микроскопии. Кроме того, проточной цитометрии могут быть использованы для обнаружения инфицированных клеток воспользовавшись флуоресценции, испускаемой бактерий, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) 16,20. Кроме того, Т-клетки transinfection можно количественно определить более чувствительной подхода, гентамицина анализа выживаемости, который позволяет измерять большое количество событий. Гентамицин вл етс антибиотиком, который не может проникнуть эукариотических клеток. Таким образом, с помощью этого антибиотика позволяет дифференцировать внутриклеточных бактерий, который пережил антибиотиками сложение FROM внеклеточные те, которые были убиты 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Т-клетки или Т-лимфоциты типа лейкоцитов, которые играют центральную роль в клеточного иммунитета и принадлежащих адаптивного иммунного ответа 26. Т-клетки являются невосприимчивыми к заражения в пробирке, но некоторые отчеты показывают, что они могут быть заражены в есте?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
Materials
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. . Molecular biology of the cell. , (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. . Medical Phisiology. , (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D’Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., Coligan, J. E. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
