T-celler Fånga Bakterier från Transinfection från dendritiska celler
Summary
Här ett protokoll presenteras för att mäta bakteriell infångning av CD4 ^ T-celler som inträffar under antigenpresentation via transinfection från pre-infekterade dendritiska celler (DC). Vi visar hur du utför nödvändiga åtgärder: isolering av galvaniska element, infektion i DC, DC / T-cell konjugatbildning och mätning av bakterie T-cell transfektion.
Abstract
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Introduction
När en patogen infekterar sin värd, finns det oftast en aktivering av de medfödda och adaptiva immunsvar, som är nödvändiga för bakteriell clearance. Medfödd immunitet är den första försvarslinjen som hindrar de flesta infektioner. Medfödd immunitet skilja på ett exakt sätt element som är konserverade bland breda grupper av mikroorganismer (patogen-associerade molekylära mönster, PAMPS) 1. Mekanismerna för medfödd immunitet innefattar fysiska hinder såsom hud, kemikalier barriärer (antimikrobiella peptider, lysozym) och de medfödda leukocyter, vilka inbegriper fagocyter (makrofager, neutrofiler, och dendritiska celler), mastceller, eosinofiler, basofiler, och naturliga mördarceller 2. Dessa celler identifiera och eliminera patogener, antingen genom att angripa dem genom kontakt eller via fagocytos, vilket inkluderar patogener uppsluka och dödande. Detta system tillåter inte livslångt försvar, i motsats till adaptiv immunitet, som ger immunologiskt minne mot pathogens. Den adaptiva immunsystemet är den andra försvarslinjen och kan känna igen och reagera på specifika antigener av flera mikrobiella och icke-mikrobiella ämnen 3. De viktigaste komponenterna i det adaptiva immunsystemet är de lymfocyter, som omfattar B- och T-celler. B-celler är involverade i det humorala svaret, som utsöndrar antikroppar mot patogener eller exogena proteiner. Emellertid T-celler representerar den cellförmedlade immuniteten, modulering av immunsvaret med cytokiner sekretion eller dödande patogenfria infekterade celler 4.
Antigenpresenterande celler (APC) inklusive dendritiska celler eller makrofager, beståndsdelar i det medfödda immunförsvaret, kan känna igen fagocytera patogener och process bakteriella komponenter till antigener, som presenteras på cellytan av MHC (MHC) 5-7. Efter APC har fagocyterats patogener, de brukar migrera till dränering lymfkörtlar, där de interagerar med Tceller. T-lymfocyter kan känna igen specifika peptid-MHC-komplex av deras T-cellreceptorer. Immun synaps (IS) förekommer i gränsytan mellan ett antigen-loaded APC och en lymfocyt under antigenpresentation 8,9. Vissa bakterier kan överleva fagocytos och sprida systematiskt inom APC. I den här vyn, infekterade APC fungerar som bakterie reservoarer eller "trojanska hästar" som underlättar bakteriespridning 10. Den intima kontakten mellan APC och lymfocyter som äger rum under IS formation fungerar också som en plattform för utbyte av en del av membran, genetiskt material och exosomes och kan kapas för vissa virus att infektera T-celler; denna process kallas transinfection 11-13.
Vissa patogena bakterier (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica och Shigella flexneri) kan invadera T-lymfocyter in vivo och ändra sitt beteende 14-16. Vi harnyligen beskrivit att T-lymfocyter har även möjlighet att fånga bakterier genom transinfection från tidigare infekterade dendritiska celler (DC) under loppet av antigenpresentation 16. T-cell bakterie fångst av transinfection ytterst effektivare (1,000-4,000x) än direkta infektioner. T-celler fånga patogen och icke-patogena bakterier indikerar än transinfection är en process som drivs av T-celler. Påfallande, transinfected T (TIT) celler dödade snabbt de infångade bakterier och gjorde det mer effektivt än professionella fagocyter 16. Dessa resultat, som bryter en dogm immunologi, visar att cellerna i adaptiv immunitet kan utföra funktioner som var förment exklusive medfödd immunitet. Dessutom visade vi att Tit celler utsöndrar stora mängder av proinflammatoriska cytokiner och skydda mot bakterieinfektioner in vivo.
Här presenterar vi de olika protokoll som används för att studera den bakteriella transinfection processen ien musmodell. Denna modell bygger på användning av CD4 + T-celler från transgena OTII möss, som bär en TCR specifik för peptid 323-339 av OVA (OVAp) inom ramen för I-Ab 17 som samverkar specifikt med bakterie infekterade ben marrow- härledda DCs (BMDCs) 18,19 laddade med OVAp, bildar stabila immun synapser.
T-cell transinfection kan visualiseras och spåras med hjälp av fluorescensmikroskopi. Dessutom flödescytometri kan användas för att detektera infekterade celler genom att dra nytta av den fluorescens som emitteras av bakterier som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) 16,20. Dessutom kan T-cell transinfection kvantifieras genom en känsligare metod, gentamicin överlevnadsanalysen som medger mätning av ett stort antal evenemang. Gentamicin är ett antibiotikum som inte kan tränga eukaryota celler. Därför använder detta antibiotikum medger differentiering av intracellulära bakterier som överlevde den antibiotiska tillsats frOM extracellulära de som dödades 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
T-celler eller T-lymfocyter är en typ av leukocyter som spelar en central roll i cellförmedlad immunitet och hör till det adaptiva immunsvaret 26. T-celler är okänsliga för att smittas in vitro men vissa rapporter visar att de kan vara smittade in vivo 14,15. De intima kontakter APC och T-celler under immun synaps fungerar som plattformar för utbyte av biologiskt material 13, inklusive några virus såsom HIV 11. Det har nyligen visat att i motsats til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
Materials
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. . Molecular biology of the cell. , (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. . Medical Phisiology. , (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D’Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., Coligan, J. E. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
