En Trombotisk Stroke model baseret på Forbigående Cerebral Hypoxi-iskæmi
Summary
Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.
Abstract
Slagtilfælde forskning har udholdt mange tilbageslag i at oversætte neurobeskyttende terapier til klinisk praksis. I modsætning hertil den virkelige verden terapi (tPA trombolyse) sjældent frembringer fordele i mekaniske okklusion baseret forsøgsmodeller, som dominerer præklinisk slagtilfælde forskning. Denne splittelse mellem bænken og bedside antyder behovet for at ansætte tPA-responsive modeller i præklinisk slagtilfælde forskning. Til dette formål er en enkel og tPA-reaktivt trombotisk slagtilfælde model opfundet og beskrevet her. Denne model består af forbigående okklusion af den ensidige fælles carotidarterie og levering af 7,5% oxygen gennem en ansigtsmaske i voksne mus i 30 minutter, samtidig med at dyret rektale temperatur ved 37,5 ± 0,5 ° C. Selv reversibel ligering af den ensidige halspulsåren eller hypoksi hver undertrykt cerebral blodstrøm kun kortvarigt, kombinationen af begge fornærmelser forårsagede vedvarende reperfusion underskud, fibrin og blodpladeaflejring, og store infarct i den midterste cerebrale arterie-leveret område. Vigtigere, hale-vene injektion af rekombinant tPA ved 0,5, 1 eller 4 timer efter THI (10 mg / kg) billede tidsafhængig reduktion af dødeligheden og infarktstørrelse. Denne nye slagtilfælde model er enkel og kan standardiseres på tværs laboratorier til at sammenligne forsøgsresultater. Endvidere er det fremkalder trombose uden kraniektomi eller indfører præformede emboli. Givet disse unikke fortjenester, at THI modellen er en nyttig tilføjelse til repertoiret af prækliniske slagtilfælde forskning.
Introduction
Trombolyse og rekanalisering er den mest effektive terapi af akut iskæmisk slagtilfælde i klinisk praksis 1. Alligevel blev størstedelen af prækliniske neurobeskyttelse forskning udført i et transient mekaniker obstruktion model (intraluminale sutur mellem-cerebral arterie okklusion), der frembringer hurtig genopretning af cerebral blodstrøm efter fjernelse af vaskulær okklusion og viser lidt at ingen fordele ved tPA trombolyse. Det er blevet foreslået, at den tvivlsomme valg af slagtilfælde modeller bidrog, i det mindste delvist, af problemer med at oversætte neurobeskyttende terapi til patienter 2,3. Derfor er der et stigende krav om at ansætte tPA-responsive tromboembolisk slagtilfælde modeller i præklinisk forskning, men sådanne modeller har også tekniske problemer (se Diskussion) 4-7. Her beskriver vi en ny trombotisk slagtilfælde model baseret på ensidig forbigående hypoxisk-iskæmisk (THI) fornærmelse og dets reaktioner på intravenøs tPA terapi 8.
Den THI slagtilfælde Modellen er udviklet på grundlag af Levine procedure (permanent ligering af den ensidige fælles halspulsåren efterfulgt af udsættelse for forbigående hypoxi i et kammer), der blev opfundet for forsøg med voksne rotter i 1960 9. Den oprindelige Levine procedure falmet i ubemærkethed, fordi den kun produceret variabel hjerneskade, men den samme fornærmelse forårsagede konsekvent neuropatologi i gnavere hvalpe da den blev genindført af Robert Vannucci og hans kolleger som en model af neonatal hypoxisk-iskæmisk encefalopati (HIE) i 1981 10. I de senere år nogle undersøgere re-tilpasset Levine-Vannucci model til voksne mus ved at justere temperaturen i hypoksiske kammer 11. Det er sandsynligt, at de inkonsistente hjernelæsioner i den originale Levine procedure kan opstå svingende kropstemperatur af voksne gnavere i hypoxiske kammer. For at teste denne hypotese, ændrede vi Levine procedure ved at indgive hypoksisk gasgennem en ansigtsmaske, under opretholdelse af gnaver kernetemperatur ved 37 ° C på det kirurgiske bord 12. Som forventet stringent kropstemperatur kontrol stærkt forøget reproducerbarhed HI-induceret hjernen patologi. HI fornærmelse udløser også koagulation, autophagy og gray- og hvid substans skade 13. Andre forskere har også brugt HI-modellen til at undersøge efter slagtilfælde inflammatoriske reaktioner 14.
En unik egenskab ved HI slagtilfælde model er, at den nøje følger Virchow triade af trombedannelse, herunder stasis af blodgennemstrømningen, endotel skade (fx på grund af HI-induceret oxidativt stress), og hyperkoagulabilitet (HI-induceret blodpladeaktivering) ( figur 1A) 15. Som sådan kan HI model fange nogle patofysiologiske mekanismer er relevante for den virkelige verden iskæmisk slagtilfælde. Med denne idé i tankerne, vi yderligere forfinet HI model med reversibel ligation af unilateral fælles halspulsåren (derfor at skabe en forbigående HI fornærmelse), og afprøvet sine reaktioner på tPA trombolyse med eller uden Edaravone. Edaravone er et gratis radikaler der allerede er godkendt i Japan til behandling af iskæmisk slagtilfælde inden 24 timer for debut 9. Vores forsøg viste, at så kort som 30 min forbigående HI udløser trombotisk infarkt, og at kombineret tPA-Edaravone behandling giver synergistiske 8 fordele. Her beskriver vi detaljerede kirurgiske procedurer og metodiske overvejelser THI model, som kan anvendes til at optimere reperfusion behandlinger af akut iskæmisk slagtilfælde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Slagtilfælde er et stort sundhedsproblem med voksende betydning for ethvert samfund med en aldrende befolkning. Globalt slagtilfælde er den anden dødsårsag med en anslået 5,9 mio fatale begivenheder i 2010, svarende til 11,1% af alle dødsfald 18. Slagtilfælde er også den tredje-hyppigste årsag til handicap leveår (DALY) mistede globalt i 2010, stiger fra femte position i 1990 19. Disse epidemiologiske data understreger behovet for mere effektive behandlingsformer af akut (iskæmisk) slagt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the NIH grant NS074559 (to C. K.). We thank all collaborators who contributed to our research articles that the present methodology report is based upon.
Materials
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~13 weeks old (22~30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in-vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in-vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in-vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-braina imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research–advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3. r. d., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow’s triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed–specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
