본 연구에서는 초구조 분석을 위한 전자 현미경 방법과 함께 생체 외 CPEC 섬모의 움직임을 실시간 관찰 및 분석할 수 있도록 상세한 광학 현미경 기술을 최적화했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
맥락막신경총은 뇌실벽에 위치하고 있으며, 뇌척수액의 생산이 주요 기능인 것으로 여겨집니다. 맥락막 신경총 조직의 표면을 덮고 있는 맥락막신경총 상피세포(CPEC)는 여러 개의 고유한 섬모를 가지고 있지만 이러한 섬모의 대부분의 기능은 아직 연구가 남아 있습니다. CPEC 섬모의 운동성과 관련된 기능을 밝히기 위해 배아, 주산기 및 출생 후 기간 동안 섬모 운동성을 모니터링하기 위해 생체 외 관찰 시스템이 개발되었습니다. 맥락막신경총을 뇌심실에서 절개하여 미분 간섭 대비 광학 장치가 장착된 비디오 강화 조영 현미경으로 관찰했습니다. 이러한 조건하에서, 생체 외 몇 시간 동안 CPEC 섬모의 운동성 프로파일을 분석하기 위한 간단하고 정량적인 방법이 개발되었습니다. 다음으로, 발달 중 섬모의 형태학적 변화를 주사 전자 현미경으로 관찰하여 섬모의 형태학적 성숙도와 운동성 사이의 관계를 규명했습니다. 흥미롭게도, 이 방법은 섬모의 수와 길이의 변화를 설명할 수 있었는데, 이는 산후 일(P) 2에서 최고조에 달한 반면, 박동 빈도는 P10에서 최대에 도달한 후 P14에서 갑작스럽게 멈췄습니다. 이러한 기술은 다양한 조직에서 섬모의 기능을 설명할 수 있습니다. 관련 기술은 이전 보고서1에서 발표되었지만, 현재 연구는 생체 외 CPEC 섬모의 운동성과 형태를 관찰하기 위한 세부 기술에 중점을 둡니다.
서론
Cilia 는 대부분의 척추 동물 세포 표면에 있는 머리카락 모양의 돌기로, 섬모병증 2-4라고 불리는 질병 부류 때문에 의학 연구자들의 관심을 끌었습니다. 세포 소기관의 유비쿼터스 발현에도 불구하고, 운동성과 생체 감지를 포함한 다양한 섬모 기능이 보고되었습니다. 예를 들어, 점막상피 표면의 운동성 섬모는 점액5과 상피 파편을 관의 출구로 운반하여 상피 표면을 청소하여 질병을 예방합니다. 더욱이, 초기 발달 시기와 배아 단계에서 섬모는 줄기세포의 증식을 조절하고6 척추동물의 좌우 비대칭 결정에 관여한다7.
맥락막총상피세포(CPEC)는 뇌의 맥락막신경총 조직 표면을 덮고 있는 신경상피세포의 파생물로, 뇌척수액(CSF)을 생성하여 두개내 환경의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. CPEC는 섬모에 특이적으로 집중되어 있는 G-단백질 결합 수용체를 통해 CSF의 생산을 조절하는 여러 개의 비운동성 섬모를 가지고 있음이 이전에 입증되었습니다8. 이러한 섬모는 정지된 비운동성 섬모로 간주되었지만, 일부 CPEC 섬모는 신생아 기간 동안 일시적인 운동성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다1.....
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프로토콜
프로토콜과 실험 동물의 사용은 야마나시와 와세다 대학의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 동물 관리 기관은 지침에 따라 수행 하였다.
1. CPEC 준비
- 다음 장치 및 재료 준비 : 바닥에서 조명을 전송하는 것이 바람직 할 수있는 스테레오 현미경,; 시계 포셉 한 쌍의 (뒤몽 # 3, # 4), 화염 멸균, 직선 운영 가위, 화염 멸균; 20 ml의 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 미디어를 포함하는 두 멸균 10cm 플라스틱 접시; 2 ml의 RT Leibovitz L-15 매체를 포함하는 35mm의 유리 바닥 요리; 70 % 에탄올을 함유하는 100 ml의 비이커; 신생아 마우스 새끼.
- 간단히 70 % 에탄올에 신생아 마우스를 담그고 운영 가위를 사용하여 잘린 빠르게 안락사.
- 멸균 10cm 디에 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 배지에서 즉시 머리를 배치SH.
- 뇌를 노출하기 위해 두개골을 열 절단, 시계 포셉의 쌍을 사용하여 덮개 뼈의 피부를 제거하고 뇌 전체를 분리 두개골 신경을 잘라.
- 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 미디어를 포함하는 새 접시에 두뇌를 전송하고 뇌가 완전히 매체에 몰입되어 있는....
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결과
흐름의 개요는 이미지 장치를 포함하여,도 1에 도시된다.
CPECs의 라이브 모션 관측
영화 1 산기 마우스로부터 단리 CPECs의 동영상을 도시하고, 동영상이 동영상 1 이미지의 확대도를 도시한다. 그것은 개별 섬모 팁 영화와 비교 정지 화상 불명확하다는 것을 알아야한다.이 프로그램을도 동영상 1 및도 2에 도시 된 데이터로부터 움직임의 다른 모드, 전후 및 회전 운동 두 섬모 운동 추적.도 3은 섬모의 궤적의 간단한 분석을 보여주는 위상차 두 좌표 회전 운동에 명백하다.
CPEC 섬모 팁 궤적의 분석
드 정량적 각 궤.......
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토론
이 방법의 관점
여기에 설명 된 기술은 이전에 발행 된 방법보다 섬모의 더 상세한 분석을 제공하지 않지만,이 기술의 중요성은 쉽게 섬모 운동 생체의 종류를 선별에 적용 할 수있는 시스템 및 비용 효율성의 단순성에있다. 특히, TI 워크 벤치 관찰하고 더 쉽게 섬모의 운동성을 분석하는 연구를 할 수있는 간단하고 사용자 친화적 인 인터페이스를 제공합니다. 효과적인 자동화 된 추적 방법은 비디오 강화 된 반면-DIC의 흠없는 섬모의 낮은 대비 개체에 대한 개발되지 않았다. 섬모 운동을 추적하는 방법은, 수동이 기술되어 있지만, 섬모 운동 추적 분석 노력의 양은 최적 화상 분석을 위해 범용 소프트웨어 패키지를 사용하는 것과 비교하여 감소된다.
샘플 해부
전자를 준비하려면X 생체 CPEC 샘플, 신속하고 부드러운 조작은 섬모 생체의 운.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 이 논문은 고립 된 맥락총 조직에서 섬모의 운동성을 관찰하는 자세한 방법을보고하는 것을 목적으로한다. 과학 참신는 이전의 연구 1,8에서보고되었다.
감사의 글
이 작업은 사립대학을 위한 프로젝트(Project for Private Universities)의 지원을 받았습니다: 일본 문부과학성(MEXT)의 매칭 펀드 보조금(T.I.)과 문부과학성(Mext)의 과학 연구 보조금(C)
의 보조금(C)을 지원받았습니다.....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 필요한 시약 | |||
| 생세포 이미징 | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| SEM 준비 | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| 행크의 균형 잡힌 소금 용액 | Life Technologies | 14170112 | |
| 파라포름알데히드 | 머크 | 1040051000 | |
| 글루타르알데히드 | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| 분자 체 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | 무수 에탄올 |
| 인산염 완충액 식염수 (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 인산염 완충액, 0.1 M | 100 ml를 만들기 위해, 0.1 19.0 ml를 섞어; M NaH2PO4 및 0.1 의 81.0 ml; M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (무수) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| 오스뮴 테트록사이드 | Nisshin EM | 300 | |
| 드라이 아이스 | |||
| [header] | |||
| 해부용 도구 및 재료 | |||
| 라이브 이미징 및 SEM 준비용 | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| 플랫 페이퍼 타월 | |||
| Φ 10cm 플라스틱 접시 | |||
| 100ml 비커 | |||
| 스트레이트 작동 가위 | Sansyo | S-2B | |
| 시계 제작자 겸자 | Dumont | No.DU-3 또는 -4, INOX | |
| 라이브 셀 이미징 | |||
| glass 바닥 접시 | Matsunami Glass | D110300 | |
| SEM 준비용 | |||
| alminum 호일 | |||
| 5ml 유리 바이알(폴리에틸렌 캡 포함 | 니치덴 Rika-Glass | PS-5A | |
| 전사 피펫 | Samco Scientific | SM251-1S | 표본 전송 |
| 이쑤시개 | 체 전사 | ||
| 이온 스퍼터용 금-팔라듐 | 히타치 | E-1030 | |
| 임계점 건조기 | Hitachi | HCP-2 | |
| [header] | |||
| 현미경 장비 및 재료 | |||
| 라이브 셀 이미징용 | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100W 수은 덩어리 하우징 및 전원 공급 장치 | Olympus | U-ULH 및 BH2-RFL-T3 | |
| 100W 수은 램프 | Ushio | USH103D | |
| DIC 집광기, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| 전동 셔터 | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 및 VMM-D1 | 수동 셔터를 사용할 수 있습니다. |
| 대역 통과 필터(400-700 nm, &파이; 45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND 필터 (Φ 45 mm) | 올림푸스 | 45ND6, 25 | %와 6% ND 여과기의 |
| 올림푸스 | UApo 40XW/340, n.a., 1.15와 IX-DPAO40 | 가진 사용된 대물 렌즈 (물 침수) | |
| ; 200Hz 프레임 속도 및 1msec의 노출 시간 | |||
| 이미지 획득/분석 소프트웨어 | 인하우스 소프트웨어 | TI Workbench | 는 높은 프레임 속도로 획득할 수 있습니다. |
| 카메라 제어 / 분석을위한 PC | 애플 | 맥 프로 | |
| 진동 차단 테이블 | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| 티슈 | 워너 인스트루먼트 | 슬라이스 앵커 키트에 | 대한 무게 그것은 U 자형 찌그러진 &Phi에 접착 된 나일론 메쉬로 만들 수 있습니다; 0.5 mm 백금 와이어. |
| 커버 유리(티슈용 대체 중량) | 마츠나미 | 주문 제작 | 커버 글라스는 티슈 웨이트로 사용할 수 있습니다. |
| SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 주사 전자 현미경 | JEOL | JSM-6510 |
참고문헌
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in d....
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재인쇄 및 허가
