Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
Test for antimikrobiel følsomhed (AST) udføres for at vurdere in vitro aktiviteten af antimikrobielle midler mod forskellige bakterier. De AST resultater, som er udtrykt ved mindste hæmmende koncentrationer (MIC) anvendes i forskning for antimikrobiel udvikling og overvågning af udviklingen modstand og i kliniske omgivelser for antimikrobiel terapi vejledning. Dalbavancin er en semi-syntetisk lipoglycopeptide antimikrobielt middel, der blev godkendt i maj 2014 ved Food and Drug Administration (FDA) til behandling af akutte bakterielle hud og hud struktur infektioner forårsaget af grampositive organismer. Fordelen ved dalbavancin i forhold til nuværende anti-stafylokok-behandlinger er dets lange halveringstid, hvilket muliggør en gang ugentlig. Dalbavancin har aktivitet mod Staphylococcus aureus (herunder både methicillin-følsomme S. aureus [MSSA] og methicillin-resistente S. aureus [MRSA]), koagulase-negative stafylokokker, <em> Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus gruppe, β-hæmolytiske streptokokker og vancomycin modtagelige enterokokker. I lighed med andre nylige lipoglycopeptide midler, optimering af CLSI og ISO bouillon følsomhed testmetoder omfatter brug af dimethylsulfoxid (DMSO) som opløsningsmiddel i forbindelse med forberedelsen stamopløsninger og polysorbat 80 (P80) for at lindre vedhæftning af midlet til plast. Forud for kliniske undersøgelser og i den første udvikling af dalbavancin blev modtagelighed studier ikke udført med brug af P-80 og MIC resultater tendens til at være 2-4 gange højere og tilsvarende højere MIC resultater blev opnået med agarfortyndingsmetoden følsomhed metode. Dalbavancin blev først inkluderet i CLSI bouillon mikrofortyndingsplader metode tabeller i 2005 og ændret i 2006 for at afklare brugen af DMSO og P-80. Bouillon mikrofortynding (BMD) viste procedure her er specifik for dalbavancin og er i overensstemmelse med CLSI og ISO metoder, med trin-for-trin detaljer og focos på de kritiske trin tilsættes for klarhed.
Dalbavancin er en semi-syntetisk lipoglycopeptide, der blev godkendt af FDA maj 2014 til behandling af akutte bakterielle hud og hud struktur infektioner forårsaget af grampositive organismer 1. Det primære mål for detaljering af denne metode i en video-format er at give klare retningslinjer for de kliniske laboratorie- og forskere til test og rapportering af nøjagtige og reproducerbare dalbavancin modtagelighed resultater.
Fastsættelsen af et antimikrobielt middel MIC af kommercielle metoder rutinemæssigt udføres i kliniske laboratorier til vurdering af en agents in vitro aktivitet mod sygdomsfremkaldende bakterier. Den her beskrevne fremgangsmåde er bouillon mikrofortynding fremgangsmåden som anbefalet af CLSI og ISO 2,3,4. Siden dalbavancin kommercielle modtagelighed metoder er i øjeblikket ikke tilgængelig (på tidspunktet for denne publikation) og disk diffusion og agar fortyndingsmetoder er i øjeblikket ikke anbefales feller dalbavancin, henvisning bouillon fortynding metoder er de aktuelle muligheder 12,14. Da denne referencemetode er ikke et kommercielt og FDA ryddet in vitro diagnostisk metode, kliniske laboratorier i USA, der bruger denne procedure for patient test skal overholde lovgivningsmæssige krav til et laboratorium udviklet test (LDT). Det forventes, at de dalbavancin brug stiger, vil flere laboratorier har behov for at teste denne forbindelse. Vancomycin prøvning som et surrogat for bestemmelse af dalbavancin modtagelighed S. aureus er blevet valideret 5. Dog kan dalbavancin være aktive mod vancomycin mellemprodukt S. aureus (VISA), og derfor kan klinikere anmode dalbavancin MIC resultater. Derudover kan MIC resultater for andre bakteriearter blive anmodet om.
FDA modtagelige breakpoint for dalbavancin mod S. aureus er blevet etableret på ≤0.12 pg / ml. FDA tildelt kun susceptible kategori på grund af manglen på data om resistente isolater. Den normale MIC fordeling blandt vildtype S. aureus isolater er mellem 0,03 til 0,12 ug / ml, med en klar modal MIC på 0,06 ug / ml. En lille variation i MIC resultater på grund af metode forskel, ud over den iboende BMD variation på ± én fortynding, potentielt kunne have en betydelig indvirkning på modtagelighed satser. 6 I lighed med andre lipoglycopeptide agenter, kan dalbavancin følsomhedsbestemmelse være udfordrende som følge af opløselighed og den relativt store størrelse af molekylet og dets bindingsegenskaber 7,8,9. Henvisningen BMD-metoden beskrevet her indeholder to specifikke skridt, der er unikke for uopløselige stoffer og / eller lipoglycopeptide agenter: (1) brugen af DMSO til fremstilling af stamopløsninger og (2) tilsætning af 0,002% P-80 i den endelige MIC-panelet fortyndinger. Formålet med denne video publikation er at skabe klarhed til dalbavancin BMD-metoden og til specifikally fokusere på disse vigtige skridt, for at sikre nøjagtige og reproducerbare MIC resultater.
Følgende metode detaljer præsenteres for yderligere overvejelser, når forberedelserne til dalbavancin MIC test. Udformningen af MIC panel vil afhænge af antallet af antimikrobielle stoffer, der skal testes (dvs.., Dalbavancin alene eller flere midler) og bakteriearter, der skal testes. De dalbavancin koncentrationer bør omfatte de fortolkende breakpoints for alle bakteriearter, der skal testes, og hele spektret af fortyndinger forventes for mindst et QC stamme. Den antimikrobielle fortyndingsrække kan organiseres enten i rækker eller kolonner afhængigt af antallet af antimikrobielle stoffer og / eller isolater / plade og en fremgangsmåde til podning. Mængden af dalbavancin pulver og bouillon bør beregnes at sikre, at optimale mængder produceres og affald er minimal. For anvendt i denne publikation eksempel mængder baseret på udarbejdelse af to MIC paneler. Kation justeret Mueller Hinton bouillon bør være forberedt og autoklaveres efter mandufacturer anvisninger og sterilitet medierne verificeres. MIC paneler kan foretages og bruges på samme dag som forberedelse eller de kan blive testet med passende kvalitetskontrol organismer og de validerede paneler lagrede frosset til fremtidig brug. Det er vigtigt at anvende sterile teknikker under hele proceduren.
Der er ingen strenge kriterier for kontrol af inokulum koncentration med kolonitællinger. Kolonitællinger kan begynde med tjekket for hver afprøvet og / eller periodisk at validere fortyndingstrinnet udføres i trin 4.2 arter. Det er vigtigt, at gyldigheden af den 0,5 McFarland standard også kontrolleres rutinemæssigt med E. coli ATCC 25922 under anvendelse af en fremgangsmåde svarende til trin 4.5. Hvis resultaterne ikke svarer til 1-2 x 10 8 CFU / ml, en ny 0,5 McFarland standard bør indhentes. Hvis kolonitællinger fra MIC brønde er uden for det acceptable område (2-8 x 10 5 CFU / ml og MIC resultater for klinisk isolat (s) varierer fra the forventede normalfordeling (f.eks. fra 0,03 til 0,12 ug / ml for S. aureus) og / eller MIC resultater for kvalitetskontrol isolat (e) er uden for forventede områder, er det nødvendigt validering afprøvning og metode modifikation kan være berettiget. Det foreslås, at en valideret 0,5 McFarland standard anvendes til at gentage kimtal (r), og hvis resultater er igen uden for forventede resultater, bør inokulum fortynding som udføres i trin 4.2 justeres og MIC gentages. Bemærk, at en renhed kontrol er nødvendig, selv hvis en kimtal udføres, fordi kolonitælling proceduren bruger en fortyndet volumen, som måske ikke nødvendigvis registrerer lavere koncentrationer af forurenende organismer.
For en MIC test kan anses for gyldig, skal acceptabel vækst forekomme i kontrol væksten godt. For de fleste bakterier, der vil blive testet mod dalbavancin (dvs.., Stafylokokker, streptokokker og enterokokker, væksten vil blive betragtet som en knap (typisk> 2 mm) og mindre frequently, kan væksten vist som turbiditet i brønden. I modsætning til nogle antimikrobielle stoffer, der kan udvise efterfølgende effekt som koncentrationer stiger, bliver dalbavancin endpoints typisk veldefinerede. Der er forskellige visning anordninger beregnet til at lette læsningen mikrofortyndingsplader tests, der kan anvendes til at læse dalbavancin holdige plader, så længe der ikke er nogen kompromis i evnen til at skelne vækst i brøndene.
De kritiske skridt i protokollen er relateret til de dele af den procedure, der er relateret til opløseligheden af dalbavancin og tilsætning af P80. Det er vigtigt, at den maksimale koncentration af dalbavancin anvendes ikke er større end 1.600 ug / ml, at DMSO anvendes som opløsningsmiddel, og at de mellemliggende koncentration fremstilles i DMSO forud for den bouillon fortyndinger, således at slutkoncentrationen af DMSO i MIC Panelet brønde ikke er større end 1%. DMSO er hygroskopisk og derfor anvendelse af ældre flasker DMSO var en consideration med hensyn til dalbavancin opløselighed. Men mens en lille BMD studie med kvalitetskontrol stammer har vist, at dette ikke at være en vigtig variabel (se resultater afsnit), er det god praksis at anvende nye eller nyligt åbnede flasker af DMSO. Det er også vigtigt, at der tilsættes P80 til suppen i det sidste trin af lægemiddel fortynding forberedelse og er ved en slutkoncentration på 0,002% i MIC godt.
Den BMD procedure medtaget her udnytter udarbejdelse af MIC paneler ved hjælp af 50 gl / brønd på dalbavancin og P-80 koncentrationer to gange den endelige koncentration og tilsætning af inokulum med 50 pl / brønd, så den endelige volumen / brønd er 100 pi. Denne metode giver mulighed for en MIC panel format, der skal produceres til afprøvning af både S. aureus og S. pneumoniae fordi lyseret hesteblod kan sættes til podestoffet. Alternative fremgangsmåder til fremstilling af MIC paneler ved hjælp af 100 pl / brønd med tilsætning af op til 10 pl / brønd er beskrevet iCLSI og ISO procedurer.
Den dalbavancin modtagelige breakpoint for S. aureus er ≤0.12 ug / ml (FDA indlægssedlen). Som det fremgår af de seneste overvågning, er de fleste af isolater hæmmet af dalbavancin i niveauer på 0,06 ug / m 15. Med en modtagelig breakpoint tæt på modal MIC, kan enhver variation i MIC som følge af metode forskelle påvirker modtagelighed satser. Fordi BMD procedure for dalbavancin indeholder nogle unikke trin (specifikt anvendelsen af DMSO i fremstilling af materiel og mellemliggende drug fortyndinger og 0,002% P80 i MIC godt, er det bydende nødvendigt, at fremgangsmåden følges nøjagtigt. S. aureus QC organisme (ATCC 29213) med en meget klar dalbavancin modal MIC på 0,06 pg / ml, har været en god indikator for metoden variation og bør anvendes rutinemæssigt at validere BMD-metoden. Hvis MIC resultater er med det forventede udbud af ,03-0,12 pg / ml, men er Trendvisning til enten lav eller HIGh side af dette interval, er yderligere validering af metoden berettiget.
Tilsætning af 0,002% P80 anbefales til alle relevante Gram-positive organismer (staphylococcci, enterokokker og streptokokker.) Det er dog bemærkelsesværdigt, at det er påvist, at lyseret hesteblod virker ligner P-80 i forhold til dets anti-bindende kapacitet og at tilføjelsen af P-80 til CAMHB + LHB har ingen yderligere effekt på dalbavancin streptokokker MIC resultater.
Der er i øjeblikket ingen disk diffusion metode til test dalbavancin og på grund af den ringe korrelation mellem BMD og AD resultater, resistensbestemmelse af dalbavancin hjælp af AD-metoden anbefales ikke 12, 14. Den BMD metode bør anvendes for den fremtidige vurdering af dalbavancin modtagelighed og som en gold standard for udvikling af kommercielle antimikrobielle følsomhedstest.
The authors have nothing to disclose.
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
Incubator (ambient) | Sanyo | ||
Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
Lab coats |