マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
眼科では、遺伝子治療は、単一遺伝子継承網膜症における治療法として浮上しています。レーバー先天性amurosis 1,2、網膜色素変性症3、および先天性脈絡膜欠如4を含む網膜色素上皮（RPE）における遺伝子に関連した継承された網膜症があります。遺伝子治療の研究分野は、前臨床研究や、 アデノ -関連ウイルス（AAV）、 レンチウイルス （LV）およびアデノウイルス （AD）などのウイルスベクターを用いた臨床試験の両方に拡大している5。別のウイルスベクターは、網膜内の異なる親和性を有しています。安全かつ効果的な遺伝子治療のために、ウイルスベクターは、注意深く標的細胞および標的遺伝子に応じて選択されるべきです。
遺伝子送達の経路は、従って、それは慎重に同様に選択されるべきで、また、細胞を標的とする効果的な遺伝子送達のために重要です。ウイルスベクターの眼内送達のための2つの最も一般的な方法は、subretされていますinal注射や硝子体内注射6。後者は、硝子体内注射は、広く滲出型加齢黄斑変性症（AMD）および糖尿病性網膜症7の黄斑浮腫で脈絡膜血管新生を治療するための薬物送達のために使用されています。硝子体内経路は、硝子体と内側の網膜へのウイルスベクターの露出を提供していますが、外側の網膜へのベクターの拡散が制限されています。一方、網膜下の経路は、ローカライズ胞を誘導する、網膜とRPEの間の潜在的な空間へのウイルスベクターの直接送達を提供します。したがって、網膜下注射は、現在、光受容体細胞およびRPEを標的とする、より効率的なルートであると考えられます。外科的アプローチの面では、プラナは、ヒト患者における網膜の損傷を避けるために硝子体内注射のための安全なエリアとして選択されているPARS。単にマウスにこの方法を変更することによって、私たちは輪部アプローチを介して、網膜下またはintravireallyウイルスベクターを注入することができます。
このビデオで記事は、我々は、マウスのRPEへのウイルスベクターの網膜下注射の簡単で便利な方法を示しています。 30 G 1/2針で角膜輪部の後方に単一の穿刺後、33 G鈍針搭載マイクロリットルのシリンジは輪部穿刺部位を介して網膜下腔に挿入されます。 1.5のウイルスベクター – 2μlのボリュームが網膜下ブレブを誘発網膜とRPEとの間の潜在的な空間に注入されます。この手順では、手術用顕微鏡を用いて直接可視化の下で行うことができます。反復練習も、ブレブ形成の直接可視化することなく、複製の結果を保証します。これは、研究者がマウスのRPEにおける網膜下の遺伝子送達のために、正確かつ時間節約実験を行うのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このビデオの記事では、RPE /脈絡膜/強膜フラットマウントの代表的な結果で詳細に輪部-アプローチ網膜下注入技術を説明しました。これは、RPEへのウイルスベクターの網膜下注射のための簡単で便利な技術です。注入時のブレブ形成の直接可視化は初心者のための正確な配達のための重要なステップです。可視化実験8-10誌で紹介し、いくつかの網膜下注入技術があります。網膜…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ソウル大学研究助成（800から20140542）によってサポートされていました、NRF / MESTのパイオニア研究プログラム（2012から0009544）、およびNRF / MESTの生体信号解析技術イノベーションプログラム（2009から0090895）、とNRF / MESTのグラント（2015M3A9E6028949）。
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
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