JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

تنفيذ المشبك التصحيح وايف مضان المجهر لرصد خصائص الوظيفية للالمعزولة حديثا PKD الظهارة

Published: September 01, 2015
doi:
10.3791/53035
, , , , ,
1Department of Physiology,Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology,University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

القنوات الأيونية التي أعرب عنها في ظهارة أنبوبي كلوي تلعب دورا هاما في علم الأمراض من مرض الكلى المتعدد الكيسات. نحن هنا وصف البروتوكولات التجريبية استخدامها لإجراء التحليل ومستوى الكالسيوم داخل الخلايا القياسات التصحيح، المشبك في ظهارة الكيسي المعزولة حديثا من الكلى القوارض.

Abstract

بدء الكيس والتوسع خلال مرض الكلى المتعدد الكيسات هي عملية معقدة تتميز شذوذ في تكاثر الخلايا أنبوبي، وتراكم السوائل اللمعية وتشكيل مصفوفة خارج الخلية. آخر من القنوات الأيونية وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا والمعلمات الفسيولوجية الرئيسية التي تحدد مهام خلايا الطلائية. طورنا طريقة مناسبة لمراقبة الوقت الحقيقي من النشاط القنوات الأيونية مع تقنية التصحيح، المشبك وتسجيل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية المعزولة حديثا من الكيسات الكلوية. الفئران PCK، وهذا نموذج الجيني للراثي مقهور مرض الكلى المتعدد الكيسات (ARPKD)، استخدمت هنا لخارج الحي تحليل القنوات الأيونية وتدفق الكالسيوم. وصف هنا هو إجراء مفصلة خطوة بخطوة تهدف إلى عزل الطبقات الوحيدة الكيسي والأنابيب غير متسعة من PCK أو العادية سبراغ داولي (SD) الفئران، ومراقبة نشاط قناة واحدة والكالسيوم داخل الخلايا 2+ ديناميات.هذه الطريقة لا تتطلب المعالجة الأنزيمية ويسمح تحليل في وضع الأصلي للالمعزولة حديثا أحادي الطبقة الظهارية. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية حساسة جدا للتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. وأخيرا، ظهارة الكيسي المعزولة يمكن أيضا استخدامها لتلطيخ مع الأجسام المضادة أو الأصباغ، وإعداد الثقافات الأولية وتنقية لمختلف فحوصات البيوكيميائية.

Introduction

القنوات الأيونية تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. مقهورة أمراض الكلى المتعدد الكيسات السائدة والمتنحية (ADPKD وARPKD، على التوالي) هي اضطرابات وراثية تتميز تطوير مملوءة بسائل الكيسات الكلوية من أصل الخلايا الظهارية أنبوبي. ويتسبب ADPKD بواسطة طفرات من PKD1 أو PKD2 الجينات التي تكود polycystins 1 و 2، والبروتينات غشاء تشارك في تنظيم تكاثر الخلايا والتمايز. PKD2 في حد ذاته أو مجمع مع PKD1 تعمل أيضا بمثابة الكالسيوم 2+ الموجبة -permeable قناة 1. الطفرات من PKHD1 ترميز الجين fibrocystin (أ-مثل مستقبلات البروتين المرتبط أهداب المشاركة في tubulogenesis و / أو صيانة قطبية ظهارة) هي دفعة الجيني للARPKD 2. هو ظاهرة معقدة رافقت نمو الكيس مع انتشار اضطراب 3،4، 5 الأوعية الدموية، فقد التمايز وفقدان القطبيةإيتي الخلايا الأنبوبية 6-8.

عيب استيعاب وإفراز المعزز في ظهارة الكيسي يسهم في تراكم السوائل في التجويف والكيس التوسع 9،10. ضعف تعتمد على تدفق [كا 2+] وقد تم ربط ط يشير أيضا إلى تكون الكيسة خلال PKD 11-15.

هنا، نحن تصف طريقة مناسبة لقياس التصحيح، المشبك النشاط قناة واحدة والخلايا مستويات الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المعزولة من الفئران PCK. تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح من قبلنا لوصف النشاط من قناة الظهارية نا + (عناق) 10 و [كا 2+] أنا معتمد على العمليات الناجمة عن الكالسيوم 2+ TRPV4 -permeable وpurinergic يشير شلال 13.

في هذه الدراسات استخدمنا الفئران PCK، وهذا نموذج من ARPKD الناجمة عن طفرة تلقائية في الجين PKHD1. كان من سلالة PCK اصلاذ المستمدة من سبراج داولي (SD) الفئران تستخدم 16 الجرذان وبالتالي التنمية المستدامة باعتبارها الرقابة المناسبة للمقارنة بسلالة PCK. ونتيجة لذلك، يمكن على حد سواء SD الفئران شرائح كليون والقنوات غير المتوسعة جمع المعزولة من الفئران PCK نفس بمثابة مجموعتين مقارنة مختلفة لتجارب على ظهارة الكيسي.

Protocol

وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان في كلية الطب في ويسكونسن وجامعة تكساس مركز العلوم الصحية في هيوستن وكان وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. الشكل 1 يوضح ا?…

Representative Results

وقد ثبت تورط محتمل في عناق تكون الكيسة من قبل العديد من الدراسات أن لوحظ تعطل عامل نمو البشرة (EGF) يشير في PKD تقدم 22-25 وغير طبيعي استيعاب الصوديوم في ARPKD نماذج الفئران والثقافات الأنسجة 26-28. على سبيل المثال، Veizis وآخرون أظهرت أن تراعي الأميلوريد نا +…

Discussion

وصفنا هنا تطبيقات التقليدية تقنية التصحيح، المشبك والتصوير epifluorescence الكالسيوم إلى الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المستمدة من نموذج الجيني الفئران من ARPKD. يتكون البروتوكول من ثلاث خطوات، والتي ينبغي أن تدفع معظم الاهتمام إلى عزل الخراجات (الخطوة 1.5 من قسم البروتوكو…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر غلين سلوكم (كلية الطب في ويسكونسن) وكولين A. لافين (الصكوك نيكون المؤتمر الوطني العراقي) للحصول على المساعدة الفنية ممتازة مع التجارب المجهري. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL108880 (لAS)، R01 DK095029 (لOPO) وK99 HL116603 (لTSP)، المؤسسة الوطنية للكلى IG1724 (لTSP)، وجمعية القلب الأميركية 13GRNT16220002 (لOPO) و وJ. زمالة بن Lipps البحوث من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى (لDVI).

Materials

Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Flou-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Tags

Keywords: Patch ClampLive Fluorescence MicroscopyPolycystic Kidney DiseasePKDARPKDIon ChannelsCalcium SignalingEpithelial MonolayerEx Vivo AnalysisPCK RatSprague Dawley RatNative SettingEpithelial IsolationImmunostainingPrimary CultureBiochemical Assays
check_url/kr/53035?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image