신 세뇨관 상피에서 발현 이온 채널은 다낭성 신장 질환의 병리에 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 갓 쥐의 신장에서 분리 낭포 성 상피 세포에서 패치 클램프 분석 및 세포 내 칼슘 수준 측정을 수행하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
다낭성 신장 질환 중 낭종 개시 및 확장은 관 모양의 세포 증식, 내강 유체 축적과 세포 외 기질 형성에 이상을 특징으로하는 복잡한 과정이다. 이온 채널 및 세포 내 칼슘 신호 전달의 활성은 관상 상피의 기능을 결정하는 중요한 생리적 파라미터이다. 우리는 갓 신장 낭종 분리 상피 단층 세포 내 칼슘 수준의 패치 - 클램프 기법 및 등록이 이온 채널 활성을 실시간으로 관찰하기에 적합한 방법을 개발 하였다. PCK 래트, 염색체 열성 다낭성 신장 질환 (ARPKD)의 유전 적 모델은, 이온 채널 및 칼슘 플럭스의 생체 외 분석을 위해 여기에 사용 하였다. 여기에 설명하는 하나의 채널 활동 및 세포 내 칼슘 역학을 낭성 단일 층 및 PCK 또는 일반 스프 라그 돌리 (SD) 쥐에서 비 넓혀 세관을 분리하고 모니터링하도록 설계 자세한 단계별 절차입니다.이 방법은 효소 처리를 필요로 갓 격리 상피 단층의 기본 설정에서 분석이 가능하지 않습니다. 또한,이 기술은 세포 내 칼슘의 변화에 매우 민감하고 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성한다. 마지막으로, 고립 된 낭성 상피 더 항체 또는 염료, 각종 생화학 적 분석을위한 차 문화의 준비 및 정제 염색에 사용할 수 있습니다.
서론
이온 채널은 세포의 성장과 분화를 포함하여 많은 생리적 기능에 중요한 역할을한다. 상 염색체 우성과 열성 다낭성 신장 질환 (각각 ADPKD과 ARPKD는) 관 상피 세포 기원의 신 유체로 채워진 낭종의 개발에 의해 특징 유전 질환이다. ADPKD는 polycystins 1 세포 증식 및 분화의 조절에 관여 2, 막 단백질을 코딩 PKD1 또는 PKD2 유전자의 돌연변이에 의해 발생된다. 그 자체로 또는 PKD1과 복잡한 PKD2 또한 칼슘 -permeable 양이온 채널 1로 작동합니다. PKHD1 유전자 부호화 fibrocystin (세뇨관 및 / 또는 상피의 극성의 유지에 관여 섬모 수용체 - 관련 단백질과 같은)의 돌연변이는 ARPKD 2 유전 자극이다. 낭종의 성장은 복잡한 현상을 방해 확산 3,4, 혈관 신생 (5), 탈분화 및 극성의 손실을 동반한다관 모양의 세포 6-8의 성만.
담낭 상피 세포에 결함이 재 흡수와 분비 증강은 루멘과 낭종 확장 9,10 유체 축적에 기여한다. 손상된 흐름 의존성 [Ca를 2+] I 시그널링도 PKD 11-1....
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프로토콜
아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 휴스턴 텍사스 건강 과학 센터의 대학의 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다. 도 1은 조직의 분리 및 처리 과정의 주요 단계를 설명한다. 간단히, PCK 또는 SD 쥐에서 신장 건강이 아닌 다이얼 세관 또는 낭종에서 하나 덕트를 수집 상피 단일 층의 수동 분리를 위해 사용된다. 여기에서 우리는 4-16 주 된 PCK 쥐 10,13에서 신장을 공부했다.
1. 신장 낭종과 연결 세관 (CNT) /의 분리 수집 덕트 (CD) 세그먼트
- 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O 2 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. 동물은 계속적으로 적절한 제작을 위해 모니터링되어야마취의 VEL. 안정적인 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다.
- 개복술을 수행하고 복부 대동맥 (17)를 통해 인산염 완충 식염수 (PBS)와 신장을 세척하십시오.
- 폴리에틸렌 튜브 카테터 (PE50)을 준비하고 PBS로 가득 주사기 펌프에 ....
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결과
cystogenesis 잠재적 ENAC 개입은 ARPKD 뮤린 모델 및 조직 배양 물에서 26-28 22-25 PKD 진행 비정상적인 나트륨 재 흡수에서 시그널링 중단 표피 성장 인자 (EGF)를 관찰 여러 연구에 의해 입증되었다. 예를 들어,은 등 Veizis. 아밀로 라이드 - 민감성 나트륨 + 흡수는 ARPKD (29)의 비 orthologous BPK 마우스 모델에서 CD 세포에서 감소되는 것으로 나타났다. 우리는 최근 낭종에 손상 나트륨과 수분 재 흡수가 cystogenesis 10 악화에 중요한 요소임을 보여 주었다. 특히, 우리는 전기 생리 및 면역 조직 화학적 분석을 고용 낭종이 무딘 나트륨 재 흡수를 발휘하는 것으로 나타났습니다. 약리학 적 접근 방식은 선택적 ENAC 봉쇄가 현저하게 낭종 진행 (10)을 악화 것을 보여 주었다.
우리는 추가로 O.......
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토론
우리는 ARPKD의 쥐의 유전자 모델에서 파생 된 담낭 상피 단층 여기에 기존의 패치 클램프 기술과 표면 형광 칼슘 이미징의 응용 프로그램을 설명했다. 프로토콜은 가장 관심 낭종 (프로토콜 부의 단계 1.5)의 단리 및 전기 생리 학적 연구에 지불되어야하는 세 단계로 구성된다. 이러한 주요 절차는 광범위한 훈련과 인내를 필요로하고, 독자는 한 번에 좌절해서는 안됩니다.
우선, 가장 관심 낭종 단층의 절연 처리를 기울여야한다. 준비의이 부분은 세포의 가시성 중요하다 유리 칩의 표본과도 첨부의 두께가 상당히 매뉴얼 기술과 영향 추가 작업을 필요로한다. 격리 된 낭종 벽의 두께는 시편의 다른 부분에서 변화, 그것은 법과 편리 큰 단층 지역에 큰 낭종에 집중하는 것이 좋습니다K. 시편을 청소 도움이 단층에 액세스하려면, 주변 조직은 실체 현미경에서 집게로 벗겨해야합니다. 이는 기술 분야의 상당한 깊이 절개 동안 다양한 크기의 객체를 수용하기 위해 다양한 배율을 변경하는 능력을 특징으.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트 Inc의)에 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는 (AS에) R01 HL108880 (OPO에) R01 DK095029과 (TSP에) K99 HL116603 (TSP에) 국립 신장 재단 IG1724 (OPO에) 미국 심장 협회 (American Heart Association) 13GRNT16220002 및 부여 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 지원되었다 (DVI에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| 폴리-L-라이신 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | 용액 |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| 라이트 소스 | Sutter Instrument Co | Lambda | XL은 셔터/필터 휠 드라이버가 통합된 |
| 중립 밀도 필터 | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 오일 |
| 카메라 | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon 현미경 (반전) | Nikon Nikon Eclipse TE2000-S | ||
| 커버 유리 | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| 다이아몬드 연필 | Fisher Scientific | 22268912 | |
| 이미지 획득 소프트웨어 | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| 이미지 분석 소프트웨어 | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND 유틸리티 플러그인을 사용하면 기본 Nikon Instruments .nd2 형식 |
| 녹음/관류 챔버 | Warner Instruments | RC-26 | |
| 패치 클램프 증폭기 | 분자 장치 | MultiClamp 700B | |
| 데이터 수집 시스템의 | 이미지를 가져올 수 있습니다.분자 장치 | Digidata 1440A | 축삭 Digidata® 시스템 |
| 로우 패스 필터 | 워너 인스트루먼트 | LPF-8 | 8 극 베셀 |
| 붕규산 유리 모세관 | 세계 정밀 기기 | 1B150F-4 | |
| 마이크로 피펫 풀러 | 셔터 기기 Co | P-97 | 화염 / 갈색 형 마이크로 피펫 풀러 |
| Microforge | Narishige | MF-830 | 일본 |
| 전동 마이크로 매니퓰레이터 | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| 도립 현미경 | Nikon | Eclipse Ti | |
| 미세 진동 절연 테이블 | TMC | 패러데이 케이지가 장착된 | |
| 다채널 밸브 관류 시스템 | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| 녹음/관류 챔버 | Warner Instruments | RC-26 | |
| 소프트웨어 | 분자 장치 | pClamp 10 . 2 | |
| 온도 조절 수술 테이블 | 설치류용 | MCW 코어 | |
| 쌍안 실체 현미경 | Nikon | SMZ745 | |
| 주사기 펌프 기반 관류 시스템 | Harvard Apparatus | ||
| 폴리에틸렌 튜빙 | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane 마취 | http://www.vetequip.com/911103 | ||
| 다른 기본 시약 | : Sigma-Aldrich |
참고문헌
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recess....
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재인쇄 및 허가
