우리는 수성 환경에서 골격 표면의 세포 친화도를 수정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 이산화 티타늄 광촉매를 이용하여 광조사된 영역에서 유기 필름을 분해합니다. 우리는 그것이 현장 및 현장 모두에서 스캐폴딩 단백질의 미세 도메인을 생성하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
이산화 티타늄의 표면 (이산화 티탄)에 흡착 된 유기 오염 물질은 자외선 (UV) 광 하에서 광촉매 작용에 의해 분해 될 수있다. 여기에서 우리는 로컬 기판 표면의 세포 친 화성을 변경할 수있는 이산화 티탄 광촉매를 사용하는 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 실험을 위해, 얇은 이산화 티탄 막은 스퍼터 - 코팅 유리 커버 슬립이며, 이산화 티탄 표면은 후속 적으로 세포 부착을 억제 옥타 데실 트리클로로 실란 (OTS)로부터 유도 된 단일 층 오가 노 실란으로 개질 하였다. 샘플은 세포 배양 배지에 침지하고, UV 광이 각형 영역에 집중 조사 하였다. 신경 세포주 PC12 세포 샘플에서 도금 될 때, 셀은 UV 조사 된 영역에 부착. 우리는 상기 셀이 상기 기판 상에 성장하는 경우에도,이 표면 개질도 즉, 인 시츄로 수행 될 수 있음을 보여준다. 표면의 적절한 수정은 세포 외 기질 P 필요콜라겐 rotein하면 UV 조사시의 중간에 존재한다. 여기에 제시된 기술은 잠재적 하에서 배양 세포를 공 배양 시스템을 구축하거나 임의로 조작 패터닝 여러 세포 유형에 이용 될 수있다.
서론
반도체 리소그래피 공정 및 그 유도체 - 포토 리소그래피 1,2, 전자빔 리소그래피 3-6 및 7-10 인쇄 마이크로 콘택트로서 - 이제 정의 된 위치 및 형상에 살아있는 세포가 성장하는 세포 생물학에서 확립 도구가되었다. 패터닝 방법은, 비 허용 세포에서 배경 허용 코팅 마이크로 섬 이루어진 미세 가공 된 기판의 사용에 의존한다. 이러한 기판 패턴 세포에 템플릿 역할을합니다. 이러한 기술은 우리에게 세포의 고유 특성을 추출하고, 세포 기반 약물 검사 (11)의 처리량을 증가시키기 위해, 단일 및 다중 세포 수준에서 세포와 그 기능을 설계 할 수있는 새로운 방법을 제공하고 있습니다.
템플릿 패턴 형상이 즉, 현장에서 변경 될 수 있다면 세포의 배양 동안 자유도 셀 패턴에서 크게 증가 할 것urface. 그들은 분위기 또는 진공에서 샘플을 처리 이후 패턴 형성 방법은 종래의 직접 여기에 적용 할 수 없다. 따라서 여러 새로운 표면 개질 기술들은 단지 몇 가지 이름을, 광 반응성 화합물 (12, 13) 또는 레이저 어블 5,14에, 예를 들면, 기준이되는, 제안되어있다. 제안 된 방법은 잘 최 ....
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프로토콜
이산화 티탄 1. 준비 유리 커버 슬립을 피복 된
- 번호 다이아몬드 스크 라이버를 이용하여 커버 슬립. 이것은 각 커버 슬립 추적 할뿐만 아니라, 시료의 정확한면이 위를 향하게되도록뿐만 돕는다. 제 피라니아 용액에 침지하여이를 다음, DDH 2 O 흐르는, 커버 슬립을 청소 (H 2 SO 4 : H 2 O 2 = 4 : 1). 10 분 후, 2 DDH O.에서 철저 8 번 커버 슬립 린스 N이 흐름에 따라 커버 슬립을 건조.
- 무선 주파수 (RF) 스퍼터링 시스템에 이산화 티탄 목표를 설정합니다. 폴리이 미드 테이프를 사용하는 스퍼터링 장치의 샘플 홀더에 부착 된 커버를. 스퍼터링 챔버에 샘플 홀더를 놓습니다. 압력이 2.0 × 10에 도달 할 때까지 실을 대피 -4 아빠를.
- 챔버 내에 Ar 가스를 도입하고 4.0 mTorr로에 증착 압력을 설정합니다. 셔터 폐쇄 유지하면서 서서히 증가(70) W.에 RF 전력
- 셔터를 열고 120-150 나노 미터 (도 1 : 단계 A)의 두께의 필름을 얻기 위해 ....
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결과
도 2a는 스퍼터 - 증착 된 이산화 티탄 필름의 단면 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지를 나타낸다. 관찰로부터, 필름의 두께는 약 150 nm 인 것으로 추정되었다. 여기에 띄는 증착 이산화 티탄 막의 평탄성이다. 원자력 현미경 (AFM)에 의한 추가 분석은면의 제곱 평균 제곱근 (RMS) 조도는 0.2nm의 (도 2B)이한다고 밝혀졌다.
이산화 티탄의 표면은 OTS로 개질하고 혈청 함유 증식 배지에 침지되는 경우, 혈청 알부민은 OTS 표면에 흡착 및 후속 단백질 흡착과 세포 부착 (18,20)을 억제한다. 집중 UV 광이 표면에 조사 될 때 계속해서, 반응성 산소 종 (ROS)은 이산화 티탄에 OTS 자기 조립 단분자막 (SAM)을 분해 SAM 및 흡착 제거 티오 2면 (21)에서
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토론
현재의 프로토콜에서, 이산화 티탄 막을 RF 마그네트론 스퍼터링에 의해 형성 하였다. 그것은 우리가 재현 서브 나노 거칠기 광촉매 이산화 티탄 필름을 제조 할 수 있기 때문에 우리는 증착이 방법을 선호. 스퍼터 증착 공정은 재료 과학자 및 전자 엔지니어 잘 알고 있지만, 생물 학자에 매우 액세스 할 수 없습니다. 이 경우에, 스핀 코팅 이산화 티탄 필름 (23)의 대안의 선택이 될 것이다. 이 방법에서, 용매에 용해 된 이산화 티탄 나노 입자는 원심력에 의해 기판 표면 상에 확산된다. 필요한 특수 장비는 스퍼터링 시스템보다 훨씬 저렴 스핀 코터이다. 우리는 자신을 위해 스핀 코팅 된 이산화 티탄 나노 입자 필름을 사용한 필름과 유사한 실험을 수행하기 위해 사용될 수 있음을 확인 하였다 (데이터는 보이지 않음). 스핀 - 코팅 된 이산화 티탄 막의 표면은 수십의 RMS 거칠기와 비교적 거친nm.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 SEM 이미징에 대한 친절한 도움에 대해 Kotaro Okubo에게 감사드립니다. 이 연구는 일본과학진흥회(Japan Society for the Promotion of Science Fund-in-Aid) 기초연구지원(B)(20310069), 연구활동창업지원기금(Grant-in-Aid for Research Activity Start-up, 25880021), 구라타 기념 히타치 과학기술재단(Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation) 및 일본재료과학공학재단(Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering)의 연구 보조금의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 유리 커버 슬립 | 워너 인스트루먼트 | CS-15R15 | 15mm 직경, # 1.5 |
| 두께 다이아몬드 스크라이버 | 오구라 보석 산업 | D 포인트 펜 | |
| RF 스퍼터링 시스템 | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 스퍼터링 타겟 | Kojundo Chemical Lab | 산화 티타늄 (IV), 순도 | , 99.9 % |
| 플라즈마 반응기 | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| 조직 배양 접시 (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| 조직 배양 접시 (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivated and pass through a 0.22 μ 사용 전 m 필터 |
| 호스 세럼 | Gibco | 26050-088 | 0.22 을 통과; μ 사용 전 m 필터 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S 신경 성장 인자 (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | 0.5 M |
| TiO2< / sub> 나노 입자 | 의 재고 솔루션 |
참고문헌
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929(2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patter....
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재인쇄 및 허가
