Studere Protein Funktion og rolle ændret protein Expression af antistof Interferens og Tre-dimensionelle rekonstruktioner

Summary

Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.

Abstract

En stram styring af proteinekspression er ikke kun vigtigt for enhver organisme i live, men også en vigtig strategi at undersøge protein fungerer i cellulære modeller. Derfor nyere forskning opfundet forskellige værktøjer til at målrette protein ekspression i mammale cellelinier eller endda dyremodeller, herunder RNA og antistof interferens. Mens den første strategi har indsamlet meget opmærksomhed i løbet af de seneste to årtier, peptider medierer en translokation af antistof laster tværs cellemembraner og ind i celler, opnået meget mindre interesse. I denne publikation giver vi en detaljeret protokol, hvordan man udnytter et peptid luftfartsselskab ved navn Chariot i humane embryonale nyreceller samt i primære hippocampus neuroner til at udføre antistof interferenseksperimenter og yderligere illustrere anvendelsen af ​​tredimensionelle rekonstruktioner analysere protein funktion. Vores resultater antyder, at Chariot er sandsynligvis på grund af dets nukleare lokaliseringssignal, particularly velegnet til at målrette proteiner bopæl i soma og kernen. Bemærkelsesværdigt, når de anvender Chariot til primære hippocampus kulturer, reagenset viste sig at være overraskende godt accepteret af dissocierede neuroner.

Introduction

En stram styring af proteinekspression er afgørende for alle levende organismer til kommando sin egen udvikling samt at reagere på miljømæssige signaler. Derfor har en mangfoldighed af mekanismer blevet opfundet under evolution til præcist at regulere ekspressionsniveauet af hvert protein kodet af app. 20.000 gener eksisterer i en eukaryot celle på et givet tidspunkt af sit liv. Finder sted på forskellige stadier af protein produktion, reguleringsmekanismer spænder fra forvaltningen af ​​kromatin struktur, transskription og RNA håndtering til retningen af ​​posttranslationelle protein modifikationer, transport og nedbrydning.

Det er derfor ikke overraskende, at funktionsfejl i den underliggende molekylære machineries og ændrede protein ekspressionsniveauerne har været forbundet med diverse sygdomme såsom kræft eller intellektuelle handicap. Faktisk ser på udestående kompleksitet neuronal udvikling og pattedyr hjernefunktion, den sensitivitet af disse avancerede systemer til ændringer i proteinekspression manifesterer sig i flere kendte intellektuelle underskud herunder Alzheimers og Parkinsons sygdom (AD og PD) samt autisme spektrum forstyrrelser (ASF) ligesom Fragile X Syndrome (FXS). Sidstnævnte sygdom er kendetegnet ved en lang misexpression af en række proteiner, som skyldes tabet af en enkelt oversættelse regulering protein, FMRP (fragilt X mental retardering protein) ^1-4. Desuden x kromosomale omlejringer påvirker variabel afgift forbundet protein A (VCXA), et protein, der styrer mRNA stabilitet og translation ved at ændre mRNA capping ^5, er for nylig blevet sat i forbindelse med intellektuel underskud, mens punktmutationer ikke blev identificeret hos patienter med kognitive handicap allerede nu ^{6, 7,} hvilket tyder på, at de observerede mentale svækkelser stammer fra ændret VCXA udtryk og dysreguleret udtryk for sit mål proteins. I overensstemmelse med disse resultater, en undersøgelse, at undersøge, om de novo kopital variationer af gener forbundet med ASF fastslået, at nye genduplikationer og sletninger er en væsentlig risikofaktor for ASD ^8, hvilket understøtter ideen om, at forhøjede eller formindskede protein udtryk niveauer kan forårsage intellektuelle underskud.

Bemærkelsesværdigt, nyere forskning yderligere bevis for, at ekspressionsniveauet af et givent protein præcist justeres for at forhindre sin sammenlægning som følge af højt proteinindhold mængder med næsten ingen sikkerhedsmarginer ^9. Det er derfor blevet foreslået, at selv små stigninger er tilstrækkelige til at fremkalde sygdomme som AD og PD ^9. Selvom de mange forskellige molekylære machineries bidrager til proteinekspression kontrol tyder på en kompleks regulering ordningen på baggrund af disse resultater en undersøgelse undersøger ekspressionsniveauet af over 5.000 pattedyrsgener ¹⁰ viste, atnatur foretrukket en mere påholdende ordning: Det cellulære overflod af proteiner viste sig at være overvejende reguleres på niveau med oversættelse ^10, hvilket illustrerer, at forvaltningen af RNA tilgængelighed primært tjener til at finjustere protein-ekspression.

Undersøgelse af dosis af proteiner af interesse (POI), er derfor ikke kun vigtigt for forståelsen af ​​de endogene funktioner af et protein, men også til undersøgelse af mange sygdomme og udvikling af terapier. Således har sidste årtier set forud for flere strategier via RNA-interferens til at manipulere POI dosering. Selvom RNA-interferens er almindeligt anvendt til at studere protein funktion og er endda anvendes i kliniske forsøg til behandling af cancer eller øjensygdomme samt at forfølge antivirale behandlinger i patienter ^11-13, kan der opstå nogle vanskeligheder, der kan gøre det umuligt strategien. For eksempel frøet sekvens, som driver knockdown ved homologi er sammenlignelighedble kort, dermed fremme off-target effekter. Siden højeffektive sekvenser er sjældne og skal findes blandt tusindvis af muligheder (anmeldt i ^14), at identificere den rigtige rækkefølge kan være tidskrævende og dyrt, men resultaterne kan stadig være skuffende.

En alternativ strategi er at direkte målrette POI med antistoffer. Her viser vi brug af proteinbærestoffet Chariot (fremstillet af Active Motif) for at reducere cellulære protein tilgængelighed, og ansættelse af tredimensionelle rekonstruktioner til at studere protein funktion efter knock-down.

Det aktive motiv af Chariot, selv en 2,8 kDa peptid, anvendes til at shuttle peptider, proteiner og antistoffer over membraner af pattedyrceller ^15. Peptid associerede virksomheder med POI'er ved at danne ikke-kovalent koblede makromolekylære komplekser udnytte hydrofobe interaktioner, hvorefter Chariot-POI komplekser internaliseres i celler i en endosom-independent måde. Vigtigere er det, Chariot var angivet til hverken påvirke den intracellulære lokalisering af pendlet proteiner, eller til at udøve cytotoksiske virkninger eller for at påvirke den biologiske aktivitet af sin last ^15.

Protocol

1. Stock Solutions Resuspender lyofiliseret aktive motiv pulver i sterilt H2O til en endelig koncentration på 2 pg / pl. Tap forsigtigt til blanding. Forbered små portioner (f.eks 12 pi hver, der kræves 2 pi per reaktion) og opbevares ved -20 ° C. 2. Forberedelse af celler Seed pattedyrceller, såsom HEK293-celler eller primære neuroner på en plade 24 brønd i 500 pi vækstmedium herunder antibiotika. BEMÆRK: Når du bru…

Representative Results

I de følgende afsnit, eksemplariske resultater illustrerer en funktionel knockdown af en POI (Simiate, for yderligere detaljer se 16, 17) ved hjælp af Chariot reagens og antistof interferens præsenteres. Resultaterne viser, at formindsket udtryk for Simiate svækker transkriptionel aktivitet, og i en dosis afhængig måde, inducerer apoptose, der kulminerede i dødelighed på over 99%, hvis højere antistof beløb (> 1 mg antistof) anvendes (disse opdagelser blev offentliggjort tid…

Discussion

Her præsenterer vi en protokol til at studere betydningen af ​​protein ekspressionsniveauerne kontrollere cellulære funktioner i en dosis drevet måde. Den beskrevne protokol giver mulighed for en finjusteret manipulation af protein-ekspression i forskellige mammale celletyper, herunder neuroner fra hippocampus, hvilket letter brugen detaljerede undersøgelser af proteinfunktion på det cellulære niveau.

Selvom RNA-interferens udgør en velkendt strategi at nedregulere POI'er, det…

Materials

Chariot	Active Motif	30025	store at -20°C
Neurobasal medium	Life technologies	21103-049	warm up to 37°C before using
1xB27	Life technologies	17504044	store at -20°C
L-glutamine	Life technologies	25030-149	store at -20°C
Penicilline and Streptomycine	Life technologies	15140-122	store at -20°C
Imaris software	Bitplane	n.a.	expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope	Zeiss	n.a.