This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
세포 외 기질 (ECM)는 ECM이 심장 혈관을 포함하여 개발 및 다양한 병리에서 중요한 역할을한다 세포 증식, 생존, 마이그레이션 등의 주요 규제이다 생물 물리학 및 생화학 적 신호를 제공 가교 단백질의 복잡한 메쉬 작업입니다 및 근골격계 질환, 섬유증, 암. 따라서, 정상과 병에 걸린 조직의 ECM의의 구성을 특징 짓는 것은 새로운 예후 및 진단 바이오 마커 및 잠재적 인 새로운 치료 대상의 식별로 이어질 수있다. 그러나, ECM 단백질의 본질 (크기가 큰 가교과 공유 결합, 크게 당화)가 도전하는 ECM의 생화학 적 분석을 렌더링하고있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 ECM 단백질의 용해성을 활용 신선하거나 동결 된 조직 및 종양으로부터 ECM의 농축 방법을 개발 하였다. 우리는 여기에서 상세 순차 I로 구성 탈세 포화 절차를 설명다른 pH와 소금과 세제 농도의 버퍼에 ncubations하고 1 결과) 세포 (세포질, 핵, 막과 세포 골격) 단백질과 ECM 단백질의 2) 농축 추출. 우리는 다음 deglycosylate 및 질량 분석에 의한 이후의 분석을위한 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 준비를 소화하는 방법을 설명합니다.
세포 외 기질 (ECM)는 부분적으로 세포와 정의에 대한 건축 지원 및 고정을 제공 가교 및 당화 단백질, 조직 '생 역학적 특성 1, 2의 복잡한 메쉬 작업입니다. ECM 단백질은 또한 세포에 직접적으로 그들의 수용체 (예를 들어, 인테그린, syndecans 등)을 통해 또는 3 시그널링 성장 인자를 변조함으로써 신호. ECM 따라서 등 증식, 생존, 편광, 분화, 이동, 같은 세포 과정의 주요 규제이다 생물 물리학 및 생화학 적 신호를 제공합니다
ECM은 생리학, 개발 및 4 노화에 중요한 역할을한다. 또한, 같은 심장 혈관 질환, 섬유증, 근골격계 질환, 암 등 여러 가지 병리,에 의해 발생하거나, ECM의 변경을 초래. 또한, ECM은 줄기 세포 틈새의 유지에 기여 번째 키 ECM 분자 식별지원 stemness에서 조직 공학 및 재생 의학 (5)에 직접 응용 프로그램을해야합니다. 그러나, 그것의 중요성에도 불구하고, ECM이 남아있다 최근까지 6 underexplored.
실리에서 분석은 ECM과 ECM 관련 단백질의 앙상블로 정의 matrisome는, 인간 및 마우스 모두 게놈 -1,7,8,8-에서 수백 유전자의 제품을 포함하는 것을 밝혔다. 그러나, ECM 단백질의 불용성은 정상 및 병리학 표본 생체 내 세포 외 기질의 조성물의 특성을 체계적 방해했다. (10) – 우리는 최근이 불용성이 유리하게 설정 될 수 있고, ECM 단백질 8을 풍부하게하는 데 사용될 수 있음을 보여 주었다. 10, 13 – 우리 등은 상기 질량 분석기는 ECM들 (8)의 조성물의 특성을 선택하는 방법 이었다는 것을 보여 주었다.
우리여기에 다른 pH와 소금과 세제 농도의 버퍼에 순차적 배양으로 구성 탈세 포화 절차를 설명합니다. 추출 (또는 고갈) 세포질, 핵, 막과 세포 골격 단백질과 ECM 단백질의 농축이 프로 시저의 결과로. 우리는 그 다음 질량 분석에 의한 이후의 분석을위한 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 준비를 소화하는 방법을 설명합니다.
자세한 여기에 설명 된 절차를 사용하여, 우리는 성공적으로 농축 및 질량 분석을 특징으로 10 개의 다른 조직과 종양 유형의 세포 외 매트릭스 한 정상 쥐의 폐 (8), 인간과 쥐의 대장 8, 9, 인간의 간 (9), 인간의 대장 종양과 파생 간 전이 (9), 흑색 종 이종 이식 (8), (게시되지 않은 나바 등.) 유방 종양 이종 이식 (10), 쥐의 췌장 섬과 쥐 insulinomas. 다른 matrisom의 비교ES는 더 잠재적 인 진단이나 예후 바이오 마커로 사용될 수있는 조직 – 및 종양 특이 ECM 서명 한 것으로 밝혀졌습니다.
우리는이 절차가 없거나 상대적으로 약간의 수정과 다른 시료에 적용 할 수 있다고 믿는다.
수정
우리는 8 열 조직 및 종양 유형에서 ECM 농축이 정확한 순서를 채용하더라도 – (10)는, 프로토콜의 수정은 다음의 경우에 고려되어야한다 :
중간 분획 ECM 단백질 1) 검출.
피브로넥틴과 라미닌을 위해 전술 한 바와 같이, 서로 다른 조직이나 종양 유형의 세포 외 매트릭스는, 자신의 추출율 / 불용성 다를 수 있습니다. 예를 들어, 섬유 성 조직 또는 조직의 리모델링 ECM 매우 동적 뒤집 것으로 생각되며, 따라서 하나는 12보다 쉽게 추출 될 그 조직 ECM 단백질의 높은 비율을 관찰하는 것이다. ECM 단백질이 검출 된 분획에 따라, 우리는 ECM 단백질의 추출을 야기하거나 공정을 생략하는 단계의 배양 시간을 줄이는 것을 제안.
2) DECM 강화 펠렛 세포 내 성분의 상당한 부분의 금 속 탐. 일부 조직 또는 종양 유형 비 세포 : ECM은 특히 높은 (예, 간, 비장, 비 종양 조직 형성)이다. 이 경우에는 (특히 세포 골격 단백질 및 / 또는 히스톤)에 의한 세포 내 단백질 ECM 풍부한 분획의 상당한 오염이 관찰 될 수있다. 효율적으로, 우리는 버퍼 M 및 / 또는 버퍼 CS (모두 포함하는 세제,이 일반적으로 풍부한 세포 내 단백질을 소모)에 두 번 배양을 반복하는 것이 좋습니다 세포 내 단백질을 소모합니다. 또 다른 대안은 (다음 문단 참조)이 아니라 상대적으로 더 가용성 ECM 단백질의 고갈을 초래할 수 있음을주의하여 높은 세제 농도가 다른 버퍼를 사용하는 것이다.
상업용 키트를 사용하여 3) 대체.
우리는 이리저리 버퍼의 정확한 조성물을 얻었다 독점적 이유로 못했다구획되지 단백질 추출 키트의 공급 업체를 해요. 그러나, 우리는 표에 유사한 추출을 수행하기 위해 정의 된 세제와 집에서 만든 버퍼 (NP-40, 나트륨 데 옥시 콜레이트와 SDS)의 농도를 사용하여 우리 자신의 경험을 바탕으로 한 노트를 포함했다. 최근의 연구는 또한 ECM 단백질 13 탈세 포화를 유지하는 버퍼의 pH의 중요성을 강조 하였다.
기술의 한계
여기에 제시된 방법은 ECM 단백질이 본질적으로 더 불용성 가장 세포 내 단백질보다 사실에 의존한다. 그러나, 탈세 포화 방법은 여기에서 설명 확실히 같은 일부 성장 인자 또는 ECM-리모델링 효소로서 ECM 내에 존재하는 수용성 성분을 추출한다. 설명 된 바와 같이 단단히 ECM 단백질에 결합 ECM 관련 단백질이 준비 시료에서 단백질 체학에서 검출되었지만,이 방법은 완전히의 구성을 프로파일 너무 엄격 할 수 matrisome 관련단백질.
다른 방법에 대해 기술의 중요성
중간 단계를 생략 할 수 있거나 ECM 단백질의 손실을 방지하거나 각각 세포 내 단백질 오염의 고갈을 증가 반복 : 다른 방법을 통해 여기에 제시된 방법의 장점은 관심 ECM의 성질에 맞게 될 수 있다는 것이다. 이 방법은 단지 후속 펩타이드 제제 및 질량 분석계와의 간섭을 방지하기 위해 오프 린스 세제의 최소량을 사용한다. 마지막으로, 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 제제를 소화하기 위해 여기에 설명 된 방법은 또한 단백질이 용해 될와 "조"ECM – 풍부 분획에서 수행 될 수 요구하지 않는 장점을 갖는다.
(예를 들어 구아니딘 하이드로 클로라이드와 같은)를 이용하는 대안 chaotropes 탈세 포화 방법 질량 분광기하는 ECM의 구성을 연구 한 ㄴEEN은 (14에서 검토) 문헌에보고 된 15, 16 및 연골, 심장 (17), 유선 (18) 및 혈관 (19) 및 (20) 사구체 기저막의 ECM 조성물의 특성을 질량 분석기와 결합하여 사용되어왔다.
추천
ECM의 분석 이후의 단백질 체학에 대한 충실 경우 트립신이 부분 ECM의 소화와 ECM 단백질과 펩티드의 손실이 발생할 것으로 세포를 소화 트립신을 사용 탈세 포화 방법은 사용할 수 없습니다. 콜라게나 제 소화 조직 중단을 돕기 위해 사용되는 것 인 경우가 ECM 분해 및 ECM 단백질 및 펩티드의 상실을 초래 마찬가지로,주의 깊게 감시 할 필요가있다.
인 – 솔루션 대에서 젤 소화? ECM 단백질 3X 램리 완충액 때에도 100mm의 DTT, 분리 PO (6 % SDS를 함유), 가교 매우 불용성이며SDS 겔에 오를리. 따라서에서 젤 소화 바람직한 방법이 아니다.
미래의 응용 프로그램
또한 여기서 설명하지는 않지만, 탈세 포화 동안 수집 중간 분획의 각각의 조성물은 또한 질량 분석에 의해 분석 될 수 있음을 주목할 필요가있다. 아주 작은 샘플 (즉, 인간의 생체 검사) 또는 공부를 할 때 특히 도움이 될 수있는 정보가 다른 세포 분수에 요구 될 때.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |