앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면
Summary
스트레스 저항은 장수의 특징 중 하나이며 유 전적으로 규율하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 장수 연구에 마우스 모델을 개발하기 위해있는 배아 줄기 세포에 스트레스 저항을 부여 돌연변이 선별 편견 높은 처리량 방법을 개발했다.
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
장수 스트레스 저항과 친밀한 관계를 가지고있다. 일반적으로, 수명이 긴 종들은 과산화수소, 파라콰트 (PQ), UV, 열, 중금속 1,2- 여러 스트레스쪽으로 저항을 증가 보여준다. 대조적으로, 스트레스 증가 감도 짧아 수명 및 / 또는 더 발생하기 쉬운 질환 표현형을 예측하는 경향이있다. 항산화 소기 경로가 긴 동물에게 스트레스 저항성을 부여하는데 중요한 역할을하는 것으로 추측하고있다. 그러나, 거의 예외없이, 다양한 항산화 제 효소 (예를 들면, SOD)의 조작과 형질 전환 동물의 다양한 연구가 산화제 소거 효소의 수준을 증가 시키면 수명 또는 건강 스팬 3을 증가시키지 않음을 나타낸다. 이러한 데이터는 지속적으로 수명이 긴 동물에서 관찰 된 스트레스 저항 특성이 아직 발견되는 다른 세포 경로에 의해 매개되는 것이 좋습니다.
우리는 편견 전달했다방법은 돌연변이 유전자에 배양 배아 줄기 (ES) 세포에서 스트레스 내성 표현형을 부여 할 수있는 유전자를 동정을 행 하였다. ES 세포는이 연구에서 두 가지 장점을 제공한다 : (1) 유전자 정교한 조작이 ES 세포의 게놈을 수정은 가능하다; 및 (2) 스크린으로부터 회수 스트레스 내성 ES 세포는 직접 수명 및 건강 범위를 측정하기 위해 전체 동물 연구에 신속한 변환을 허용 마우스 생산에 사용될 수있다.
이보고에서는, 대립 유전자가 BLM 테트라 사이클린 반응성 소자에 의해 제어 된 C9에 ES 세포주의 사용을 설명했다. 독시 싸이클린 (DOX)의 치료는 일시적으로 자매 염색 분체 교환의 증가 사고로 이어지는 BLM의 발현을 해제. 이 단기적으로는 BLM 노크 아웃 이질 집단 내에서 동형 접합 돌연변이의 생성을 허용 스트레스 저항 열성 돌연변이가 심사 과정에서 캡처 할 수 있도록. 우리또한 무작위 게놈에서 유전자 돌연변이 폴리 트랩 카세트 (PB-UPA)를 삽입 돌연변이로 피기 백 (PB) 트랜스포존의 사용을 설명했다. 폴리 트랩에 의해 유전자의 파괴와 세포 G418 내성이되었고, 유전자 트랩 돌연변이 (유전자 트랩 라이브러리)의 컬렉션을 만들고, 이후에 강한 스트레스했다 돌연변이 클론 상영 될 수 있도록 복구 할 수 있습니다.
선택으로부터 회수 스트레스 내성 클론 삽입의 수 (qPCR에)의 점에서, 분자의 기술에 의해 다소 빠르게 특성화 될 수 삽입 사이트 (splinkerette PCR), 파쇄 유전자 (BLAST)의 신원, 및 그 발현 량 ( RT-qPCR에). PB 삽입은 야생형 DNA 서열을 복원하고, 따라서 응력의 저항 손실을 테스트 할 클론의 MPB 트랜스의 일시적 발현으로 remobilized 될 수있다. 이들은 이전에 수행해야 돌연변이의 인과 관계를 확인하는 강력한 방법이다비싼 마우스 생산. 이전의 연구는 스트레스에 노출 된 세포가 만능의 4,5을 잃은 것으로 나타났다. 따라서,이 프로토콜에서, 스트레스로 처리되지 않는다 돌연변이 세포의 집합 복제, 보존 성공적인 마우스 생산에 중요하다.
우리 연구소는 모두 요청에 따라 다른 연구자가 사용할 수있는, C9 ES 세포 라인과 PB-UPA 벡터를 설계하고있다. 여기에보고 된 프로토콜은 스트레스 내성 클론 (그림 1B)를 분리하기 위해 복제 도금과 스트레스의 선택에 따라 PB-UPA (그림 1A)와 유전자 갇혀 ES 세포의 드 노보 라이브러리의 생성에 의해 시작됩니다. 우리는 파라콰트, 세포 내부의 강력한 활성 산소 발생기 선택을 보여 주었다. 사실상, 예를 들어 임의의 세포 독성 화합물 또는 독소, ER 스트레스 요인 (예, 및 쌥시 가르 긴 tunicamycin), 신경 세포의 산화제 (예를 들어, MPP +, 6- 히드 록시 도파민 및 로테 논), 열, 또는 무거운금속 (예를 들면, CD, SE는) 각각 내성 돌연변이 체에 대해 선택하는 방법에 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Molecular Biology | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
References
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