Abordagem genética para a frente para descobrir genes de resistência a estresse em ratos - Uma tela de alta capacidade em células ES
Summary
Resistência ao estresse é uma das marcas para a longevidade e é conhecido por ser geneticamente governada. Aqui, desenvolvemos um método de alto rendimento imparcial para triagem de mutações que conferem resistência ao estresse em células ES com que para desenvolver modelos de rato para estudos de longevidade.
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
A longevidade tem uma relação íntima com a resistência ao estresse. Em geral, as espécies de vida longa demonstram muitas vezes uma maior resistência para vários factores de stress, tais como peróxido de hidrogénio, paraquato (PQ), UV, calor, e metais pesados 1,2. Em contraste, o aumento da sensibilidade ao stress tende a predizer a vida encurtada e / ou um fenótipo de doença mais propensas. A via de eliminação de anti-oxidante tem sido especulado para desempenhar um papel importante no que confere resistência de stress ao animal. No entanto, com poucas exceções, os estudos de uma variedade de animais transgênicos com manipulações em várias enzimas anti-oxidantes (por exemplo, SOD) indicam que o aumento do nível de enzimas eliminadoras oxidantes não aumenta vida útil ou extensão de saúde 3. Estes dados sugerem que o traço de resistência ao estresse consistentemente observado em animais de longa duração é mediada por outras vias celulares ainda para ser descoberto.
Nós pegamos uma frente imparcialabordagem genética para identificar genes, que após mutação, poderia conferir um fenótipo de resistência ao estresse em células estaminais embrionárias cultivadas (ES). As células ES oferecem duas vantagens principais neste estudo: (1) manipulação genética sofisticadas estão disponíveis para modificar o genoma das células ES; e (2) as células ES resistentes estresse recuperados a partir do ecrã pode ser usado directamente para a produção do mouse, permitindo rápida tradução em estudos com animais inteiros para medir tempo de vida útil e de saúde.
Neste relatório, nós descrevemos o uso de linha de células C9 ES, em que os alelos Blm estavam sob controle por um elemento que responde a tetraciclina. Tratamento de doxiciclina (dox) transitoriamente desligada a expressão de Blm levando a um aumento de incidentes de troca de cromátides irmãs. Este curto prazo Blm knock-out permitiu a geração de mutações homozigotas numa população de heterozigotos, de modo que mutações recessivas para resistência stress pode ser capturado no processo de rastreio. Nóstambém descreveram a utilização de piggyBac (PB) como a transposão mutagénica para inserir aleatoriamente um poli-A cassete armadilha (PB-UPA) para mutar os genes no genoma. As células com um gene de ruptura pela poli-A armadilha se tornou resistente a G418 e pode ser recuperado de modo a que um conjunto de mutantes de gene-trap (biblioteca de genes-trap) pode ser feita, e subsequentemente pesquisada quanto a clones mutantes que eram resistentes ao estresse.
Os clones resistentes de Stress recuperados a partir da selecção poderia ser caracterizada bastante rapidamente por meio de técnicas moleculares no que se refere ao número de inserções (qPCR), o local de inserção (splinkerette PCR), a identidade do gene interrompido (BLAST), e o seu nível de expressão ( RT-qPCR). A inserção pode ser PB remobilizados por expressão transiente de MPB transposase no clone para restaurar a sequência de ADN de tipo selvagem e, portanto, para testar a perda de resistência à tensão. Estas são maneiras poderosas para confirmar a causalidade da mutação, o que deve ser feito antesa produção caro mouse. Estudos anteriores mostraram que as células expostas a estressores perderam a 4,5 pluripotência. Assim, neste protocolo, a preservação de um conjunto de réplicas de células mutantes, que não seriam tratados com fatores de estresse é fundamental para a produção bem sucedida mouse.
Nosso laboratório projetou a linha de células ES C9 eo vetor PB-UPA, ambos estão disponíveis para outros pesquisadores, mediante solicitação. O protocolo aqui relatado começará pela geração da biblioteca de de novo de células ES preso por genes com OP-UPA (Figura 1A), seguido de réplica de placas e selecção de stress para isolar os clones resistentes de tensão (Figura 1B). Nós demonstramos a seleção com paraquat, um potente gerador de radicais livres dentro das células. Praticamente, qualquer composto citotóxico ou toxina, por exemplo, factores de stress ER (por exemplo, tapsigargina e tunicamicina), neuronal oxidante (por exemplo, MPP +, dopamina 6-hidroxi, e rotenona), do calor, e pesadometais (por exemplo, CD, SE), poderia ser adaptada para o método de escolha para os respectivos mutantes resistentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Molecular Biology | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
References
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