Méthode d'étude Palatal Fusion utilisant statique Organ Culture

Summary

Des études de développement du palais sont motivés par l'incidence de la fente palatine, un défaut de naissance qui impose un fardeau de santé énorme et peut laisser durablement défigurée. Nous démontrons ici d'une technique de culture étagères palatines qui peuvent être utilisés pour étudier différentes voies de signalisation impliquées dans le développement palatine et de la fusion.

Abstract

Fente labiale et palatine sont parmi les plus communs de toutes les anomalies congénitales. Les formes de palais secondaire des tablettes mésenchymateuses couverts par un épithélium qui adhère à former la couture médiane épithéliale (MES). Les théories suggèrent que les cellules MES suivent une transition épithélio-mésenchymateuses (EMT), l'apoptose et la migration, faisant un palais fusionné ^1. Désintégration complète du MES est la phase essentielle finale de palatine confluence avec entourant les cellules mésenchymateuses. Nous fournissons une méthode de culture d'organe de palais. Le point dans le protocole vitro permet l'étude des processus biologiques et moléculaires lors de la fusion. Les applications de cette technique sont nombreux, y compris les réponses à l'évaluation des agents chimiques exogènes, des effets des facteurs réglementaires et de croissance et des protéines spécifiques. Culture d'organe palatine a un certain nombre d'avantages, y compris la manipulation à différents stades de développement qui est pas possible en utilisant des études in vivo.

Introduction

Fentes faciales sont prédominants défauts de naissance les cranio-faciales. Aussi, en prenant en considération tous les défauts cranio-faciales possibles, ceux-ci sont la deuxième anomalie de naissance le plus commun chez les nouveaux nés ^2. Fentes palatines se produisent à environ 1 pour 700 naissances aux États-Unis (US) chaque année, l'incidence de la fente palatine est égale à 475 enfants nés avec une fente palatine par mois ou 15 enfants atteints de fentes par jour ^3. Environ 1% des enfants nés dans le monde chaque année présentent une certaine forme de dysmorphie cranio-faciale.

Fentes du palais et la lèvre ont besoin d'une procédure très coûteuse et complexe avec des implications pour la vie pour les patients qui ont cette anomalie. Le coût estimé pour chaque patient avec fente orale est d'environ 100 000 ^$ 4. Le traitement d'un patient avec fente labiale et palatine nécessite une équipe de médecins, y compris cranio-faciales chirurgiens, orl, des généticiens, des anesthésistes,-orthophonistes, des nutritionnistes, des orthodontistes, prothésistes, des psychologues, des neurochirurgiens, et les ophtalmologistes.

Dans palatogenesis, le palais secondaire se pose excroissances paires, qui se développent d'abord verticalement et subissent palatine plateau élévation au-dessus du dos de la langue. Après l'élévation, les étagères palatines appariés poussent vers la ligne médiane (à E14.5 -E15 chez la souris et chez l'homme la semaine 9). L'épithélium de bord médial (MEE) qui couvre la pointe du plateau adhère formant la couture médiane épithéliale.

Ceci est suivi par transition épithélio-mésenchymateuse et / ou de l'apoptose pour permettre mésenchymateuses confluence. Adhésion d'opposer MEE est un événement essentiel dont l'altération provoque une fente palatine. Cependant, peu d'études ont étudié l'adhérence initiale des lames palatines ^5. Les formes palais dur par la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes de. Le développement anormal du palais peut produire cleft palais avec ou sans la participation de la lèvre.

Techniques de culture d'organes palais avaient été largement utilisés pour de nombreux laboratoires au cours des 30 dernières années ^6,7.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail une méthode de dissection palatine et de la culture d'organe statique. L'avantage d'une culture d'organe immobile est qu'il permet de fusionner étagères palatines. Cette technique a été utilisée avec succès dans notre laboratoire pour de nombreuses fusion et de signalisation expériences ^8,9. Toutefois, le champ d'application de la technique est très grande et peut être utilisé chaque fois que système de culture d'organe statique est nécessaire, y compris l'évaluation des réponses à des agents chimiques exogènes, les effets de facteurs de croissance dans différentes voies de régulation et des protéines spécifiques.

Figure 1. Souris Palatogenesis. Les stades de développement de la bouche de souris. (BF) ele de numérisationmicrographies cTRON (SEM) du palais secondaire à des moments représentatifs de développement. Les flèches rouges montrent: la partie initiale de l'adhésion palatine et de la fusion. Les flèches jaunes: le point à l'espace entre les palais primaires et secondaires qui vont disparaître après la fusion (Repris de Kaufman ¹¹ avec la permission de la revue PLoS ONE).

Protocol

Toutes les procédures décrites doivent être effectuées en conformité avec les directives et règlements pour l'utilisation d'animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux locale. 1. Préparation des instruments de dissection et Culture Media Prélavage tous les instruments à utiliser dans la dissection avec 3% de peroxyde d'hydrogène, puis autoclave à 121 ° C pendant 20 …

Representative Results

La technique peut être appliquée à différents types de experiments.The étude suivante a été conçu pour tester l'effet tératogène de la nicotine in vitro sur palatine fusion. Deux souches de souris ont été utilisées pour cette expérience, CD1 et C57.Palatal tissu a été traitée avec 0,06 mM et 6 concentrations de nicotine hémisulfate. Il a été observé que les schémas de fusion palatines et le calendrier étaient différents dans les deux souches différentes. Chez la souris CD1, des éta…

Discussion

Le protocole à cet article fournit une méthode de disséquer étagères palatines à partir d'embryons au jour embryonnaire 13,5. Étagères palatines des embryons de souris ont été cultivées dans un milieu de culture exempt de sérum dans une atmosphère de 95% d'O _{2 5%} de CO2 à 37 ° C. Palatal dissection réussie dépend de manière critique de plusieurs facteurs, à chaque étape au cours de la procédure à partir du moment embryonnaire des souris euthanasiés à la fin de la culture. Un de…

Materials

 

BGJb	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100X
Petri dishes	VWR	25384-088	100x15mm
Center-well organ culture dish	Falcon	#353037	60×15 mm
Wire triangular grid	Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.
Polycarbonate filter	GE& Water and Process Technologies	K04BP04700	Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope	ZEISS  Stemi SR
Culture hood	NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps	Dumont Medical		#5
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14003-G	Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS500086	Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14127-G	Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula)	Hu-friedy		CM 2/4
Protector laboratory hood	Labconco
Incubator	Thermo Scientific		Farma
			Series11 water Jacket
			Co2 incubator
PBS	GIBCO	10010-023	1X
Fiber optic Light source	Fiber-light  Dolan-Jenner	PL-750
Embedding cassette	Statlab	EC301
Kim Wipes	VWR	470173-504