Método de estudio palatina Fusión usando estático Organ Culture
Summary
Los estudios sobre el desarrollo del paladar están motivados por la incidencia de paladar hendido, un defecto de nacimiento que impone una carga de salud tremenda y puede dejar la desfiguración permanente. Se demuestra aquí una técnica para estantes cultura palatinas que se pueden utilizar para estudiar diferentes vías de señalización implicadas en el desarrollo de paladar y la fusión.
Abstract
El labio leporino y el paladar se encuentran entre los más comunes de todos los defectos congénitos. Las formas de paladar secundario de estantes mesenquimales cubiertas de epitelio que se adhiere al formar la costura epiteliales de la línea media (MES). Las teorías sugieren que las células MES siguen un epitelio de transición mesenquimal (EMT), la apoptosis y la migración, haciendo un paladar fusionado 1. La desintegración completa de la economía de mercado es la fase esencial definitiva de confluencia del paladar y la zona células mesenquimales. Ofrecemos un método para cultivo de órganos paladar. La desarrollado protocolo in vitro permite el estudio de los procesos biológicos y moleculares durante la fusión. Las aplicaciones de esta técnica son numerosas, incluyendo la evaluación de las respuestas a los agentes químicos exógenos, efectos de los factores de regulación y de crecimiento y proteínas específicas. Cultivo de órganos Palatal tiene una serie de ventajas, incluyendo la manipulación en diferentes etapas de desarrollo que no es posible utilizando los estudios in vivo.
Introduction
Hendiduras orofaciales son los defectos congénitos craneofaciales más predominantes. Además, tomando en consideración todos los posibles defectos craneofaciales, se trata de la segunda anomalía de nacimiento más común en los recién nacidos 2. Paladar hendido ocurren en aproximadamente 1 de cada 700 nacimientos en los Estados Unidos (US) todos los años, la incidencia de paladar hendido es igual a 475 niños nacidos con paladar hendido al mes o 15 niños con hendiduras por día 3. Aproximadamente el 1% de los niños nacidos en todo el mundo cada año presentan algún tipo de dismorfología craneofacial.
Las hendiduras del paladar y el labio necesitan un procedimiento muy costoso y complicado con implicaciones para toda la vida para los pacientes con esta anomalía. El costo estimado para cada paciente con fisura oral es de aproximadamente $ 100.000 4. El tratamiento de un paciente con labio leporino y paladar hendido requiere un equipo de médicos, incluyendo craneofaciales cirujanos, otorrinolaringólogos, genetistas, anestesiólogos,patólogos del habla-lenguaje, nutricionistas, ortodoncistas, protesistas, psicólogos, neurocirujanos y oftalmólogos.
En palatogénesis, paladar secundario surge como excrecencias pareadas, que inicialmente crecen verticalmente y se someten a la elevación estante palatina sobre el dorso de la lengua. A raíz de la elevación, los palatinos pareadas crecen hacia la línea media (en E14.5 -E15 en ratones y la semana 9 en los seres humanos). El epitelio borde medial (MEE) que cubre la punta estante se adhiere formando la costura epitelial línea media.
Esto es seguido por epitelial a mesenquimal transición y / o apoptosis para permitir la confluencia mesenquimales. Adhesión de oponerse MEE es un evento esencial cuya alteración provoca paladar hendido. Sin embargo, sólo unos pocos estudios investigaron la adhesión inicial de palatinos 5. Las formas de paladar duro por la diferenciación de las células mesenquimales en osteoblastos. El desarrollo anormal del paladar puede producir cleft paladares con o sin la participación del labio.
Técnicas de cultivo de órganos Paladar habían utilizado ampliamente durante muchos laboratorios en los últimos 30 años 6,7.
En este protocolo se describe en detalle un método de la disección del paladar y de la cultura de órganos estática. La ventaja de un cultivo de órganos inmóvil es que permite palatinos se fusionen. Esta técnica se ha utilizado con éxito en nuestro laboratorio para muchos de fusión y de señalización experimentos 8,9. Sin embargo, el ámbito de aplicación de la técnica es muy amplia y se puede utilizar siempre que se requiera el sistema de cultivo de órganos estática, incluyendo la evaluación de las respuestas a los agentes químicos exógenos, los efectos de los factores de crecimiento de regulación en diferentes vías y proteínas específicas.
Figura 1. Ratón palatogénesis. Etapas de desarrollo del paladar ratones. (BF) ele Escaneomicrografías ctron (SEM) del paladar secundario en tiempos de desarrollo representativas. Flechas rojas: muestran la parte inicial de la adhesión del paladar y la fusión. Flechas amarillas: punto al espacio entre los paladares de primaria y secundaria que desaparecerán después de la fusión (Tomado de Kaufman 11 con permiso de PLoS ONE).
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo en este artículo proporciona un método de disección palatinos de los embriones en el día embrionario 13.5. Palatinos de embriones de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% de O 2 5% de CO 2 a 37 ° C. Disección palatina éxito depende fundamentalmente de factores múltiples en cada paso durante el procedimiento desde el momento embrionario de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura. Uno de los factores más importantes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have any acknowledgements.
Materials
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100x15mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60×15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| Co2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 | |
References
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