Summary

Statik Organ Kültürü kullanarak Palatal Fusion incelenmesi yöntemi

Published: September 19, 2015
doi:

Summary

Damak gelişimi çalışmalar yarık damak, muazzam bir sağlık yük getirmektedir ve şekil bozukluğuna kalıcı bırakabilirsiniz doğum defekti insidansının motive etmektedir. Biz burada damak gelişimi ve füzyon içinde yer alan farklı sinyal yollarını incelemek için kullanılabilecek kültür damak raflarına bir tekniği göstermek.

Abstract

Yarık dudak ve damak, tüm doğum kusurları en yaygın arasındadır. Orta hat epitel dikiş oluşturmak yapışır epitel ile örtülü mezenkimal raflardan ikincil damak formları (MES). Teoriler MES hücreler kaynaşmış damak 1 yaparak, mezenkimal geçiş (EMT), apoptoz ve göç bir epitel izleyin öneririz. MES tam parçalanma mezenkimal hücreler çevredeki damak izdiham son temel aşamasıdır. Bu damak organ kültürü için bir yöntem sağlamaktır. In vitro protokol geliştirilen füzyon sırasında biyolojik ve moleküler proseslerin çalışma sağlar. Bu tekniğin uygulamalar harici kimyasal ajanlara değerlendirilmesi tepkiler, düzenleyici ve büyüme faktörleri ve spesifik proteinlerin etkileri de dahil olmak üzere, çok sayıda bulunmaktadır. Palatal organ kültür in vivo çalışmalar ile mümkün değildir farklı gelişim safhalarında manipülasyon da dahil olmak üzere bir dizi avantaj vardır.

Introduction

Orofasial yarıklar en baskın kraniofasyal doğum kusurları vardır. Ayrıca, göz olası tüm kraniofasial kusurları alarak, bu yenidoğanların 2 en sık görülen ikinci doğum anomalisi bulunmaktadır. Yarık damak, yaklaşık 1 Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) her yıl her 700 doğumda meydana, yarık damak insidansı yarık ayda damak veya gün başına 3 yarıkların 15 çocuklu doğan 475 çocuk eşittir. Çocuklar yaklaşık% 1, her yıl sergilediğini dünyada kraniyofasiyal dismorfoloji çeşit doğdu.

Damak ve dudak yarıkları, bu anomali olan hastalarda yaşam boyu etkileri olan bir çok pahalı ve karmaşık prosedür gerekiyor. Oral yarıklı her hasta için tahmini maliyeti yaklaşık 100.000 $ 4'tür. Dudak ve damak bir hastanın tedavisi, kraniofasial cerrahlar, kulak burun boğaz, genetikçiler, anestezist de dahil olmak üzere doktorların bir ekip gerektirirkonuşma-dil patologlar, beslenme, ortodontist, prostodontist, psikologlar, beyin cerrahları ve göz doktoru.

Palatogenesis, ikincil damak başlangıçta dikey büyümeye ve dil sırtında üzerinde damak raf yüksekliği geçmesi eşleştirilmiş çıkıntılar olarak ortaya çıkar. Yükseklik ardından, eşleştirilmiş damak raflar (insanlarda, farelerde E14.5 -E15 ve haftanın 9) orta hat doğru büyür. Raf ucu kapakları medial kenar epiteli (MEE) orta hat epitel dikişi oluşturan yapışır.

Bu mezenkimal izdiham izin vermek için mezenkimal geçiş ve / veya apoptoza epitelyal izlemektedir. Karşıt MEE yapışması olan değişiklik yarık damak neden temel bir olaydır. Ancak, sadece birkaç çalışma damak raflar 5 başlangıç ​​yapışma araştırdık. Osteoblast içine mezenkimal hücrelerin farklılaşması ile sert damak formları. Clef üretebilir damak anormal gelişimt veya dudak katılımı olmadan damakları.

Damak organ kültürü teknikleri, son 30 yılda 6,7 boyunca birçok laboratuvarlar için yaygın olarak kullanılır olmuştu.

Bu protokolde ayrıntıları damak diseksiyon ve statik organ kültürü bir yöntem açıklanmaktadır. Hareketsiz bir organ kültürü avantajı damak raflar kaynaştırmak olanak sağlamasıdır. Bu teknik pek çok füzyon ve sinyalizasyon deneyler 8,9 bizim laboratuvarda başarıyla kullanılmıştır. Tekniğin kapsamı geniş ve statik organ kültürü sistemi eksojen kimyasal maddelere yanıtların değerlendirilmesi de dahil olmak üzere, gerekli olduğunda kullanılabilir Ancak, farklı yollar ve spesifik proteinlerin düzenleyici büyüme faktörlerinin etkileri.

figür 1
Şekil 1. Fare Palatogenesis. Fareler damağın Gelişim aşamaları. (BF) Tarama eletemsili gelişim zamanlarda ikincil damak cTRON mikrograflan (SEM). Kırmızı oklar: damak yapışma ve füzyon ilk bölümünü gösterir. Sarı oklar: füzyon sonra kaybolur birincil ve ikincil damak arasındaki boşluğa gelin (PLoS biri izni ile Kaufman 11 yeniden basıldı).

Protocol

Açıklanan tüm prosedürler yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onayı dahil olmak üzere, omurgalı hayvanlar, kullanımına yönelik kurallar ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır. Kesme Aletleri ve Kültür Medya 1. Hazırlık Ön-yıkama, bütün araçların% 3 hidrojen peroksit ve 20 dakika boyunca 121 ° C'de daha sonra otoklav ile diseksiyon kullanılmak üzere. Bir kaputu vakum emme ile 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre kullanıla…

Representative Results

Tekniği experiments.The Aşağıdaki çalışma farklı uygulanabilir damak füzyon üzerinde in vitro nikotin teratojenik etkisini test etmek için tasarlanmıştır. Farelerin iki suş Bu deney için kullanılmıştır, CD1 ve C57.Palatal dokusu nikotin hemisülfatın 0.06 6 mM konsantrasyonları ile muamele edilmiştir. Bu damak füzyon desen ve zamanlama iki farklı suşları farklı olduğu görülmüştür. CD1 fareleri, kontrol grubundan damak raflar zamana bağlı bir şekilde füzyon devam et…

Discussion

Bu makalede protokolü embriyonik gün 13,5 olarak embriyolardan damak raflar kesme için bir yöntem sağlar. Fare embriyosu Palatal raflar 37 ° C 'de 95% O 2,% 5 CO2 atmosferi içinde serumsuz kültür ortamı içinde kültürlenmiştir. Başarılı damak diseksiyonu kültürünün tamamlanmasına ötenazi farelerin embriyonik zaman işlem sırasında her adımda birçok faktöre kritik bağlıdır. Damak füzyon etkileyen en önemli faktörlerden biri, organ kültürü başlatmak için harcanan zaman …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors do not have any acknowledgements.

Materials


 

BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100x15mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60×15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
Co2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, . principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. . Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).
  11. Kaufman, M. H. . The Atlas of Mouse Development. , (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

View Video