שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה
Summary
באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים.
Abstract
The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.
Introduction
במערכת השמיעה, אם כי יש עיבוד משמעותי של מידע בין הפריפריה החושית וcolliculus הנחות, יש עיבוד נוסף רב לפני שהוא מגיע לקליפת המוח השמיעתי. אנחנו יודעים מעט מאוד על איך העיבוד שנעשה ולכן קצת על איך שינוי שמאפשר למוח לפרש מידע חושי. למעט חוש ריח, כל אחד מהחושים יש ארגון דומה מאוד עם אותות היקפיים בתחילה שהעבירו עם איכות גבוהה שיורדת כאות עולה לקליפת המוח. הקליפה לאחר מכן שולחת תחזיות למבנים נמוכים יותר לווסת את המידע הנכנס נוסף. מערכת מורכבת זו נחקרה במגוון הדרכים in vivo, כמו גם במספר ההכנות במבחנה. בעבר, כל החיבורים שלמים, המאפשרים לחוקר לחקור כל מערכת של קשרים, תוך שליטה על הקלט החושי ומדידהתפוקה בכל אזור נתון. עם גישה זו, יש לא מעט שליטה על המגוון הרחב של תשומות אחרות, כוללים תשומות אחרות חושיות, עוררות, ותשומת לב, והוליד פלט עוצמה מורכב. במבחנה, פרוסות המוח קוצצו כדי ללכוד או קבוצה אחת של תחזיות, או שני אזורים במוח מקושרים, שתאפשרנה לחוקרים כדי לעורר ולהעריך שונים afferents או אזורים במוח. אלה הם בדרך כלל פרוסות או thalamocortical או tectothalamic בי או הקלט לתלמוס או התלמוס והתפוקה שלה לקליפת המוח נשמרים 2-5. הכנות אלו מאפשרות מגוון רחב של מניפולציות תרופתיות, חשמל, וoptogenetic. עם זאת רק עם שני אזורים במוח, הם בעיקר להעריך את העברת המידע וחוסר היכולת להעריך את הפיכתו של המידע כפי שהוא עובר דרך התלמוס. גם ההקרנה reticulo-התלמוס, שעשוי לשחק תפקיד באפנון תשומת לב היא 6-9 יחסי ציבורesent בפרוסה זו. כאן אנו מדגימים שיפורים על ההכנה הקודמת שלנו 1, המאפשרת שליטת חוקר תשומות שונות להתלמוס לתת נקודת מבט ייחודית של איך מידע שערי התלמוס ומסננים. אנחנו זוג הכנה זה רומן עם פרוסת ההדמיה autofluorescence flavoprotein להערכת קישוריות פרוסה וניתוח הפעלה בקנה מידה גדולה, הדמיה סידן בתלמוס לניתוח אוכלוסייה עצבית, והקלטת תא בודדת כדי למדוד את ההשפעה של התשומות השונות ברמה תא בודדת.
כדי לסייע בשמירה על קשרים ענפים אלה יש לנו גם פיתחו מספר השינויים של עוגן פרוסה הרגיל (aka "נבל") לקיום פרוסת המוח במקום וגשר לרומם את הפרוסה לזלוף משופר. הנבל מעוצב בצורת פרסה שונה כדי להקיף את הפרוסה ולאפשר לנקודות מצורפים להתאמה אישית למייתרי הנבל. שלושה מייתריםמצורף כזה ש) אחד טמון אופקי לאורך הקצה המדיאלי של הפרוסה, ii) אחד משתרע מקצה הזנב של IC לקצה הזנב של AC וiii) אחד משתרע באלכסון מהקצה המדיאלי של הפרוסה לאזור מקורי לAC (ראה איור 1 א). חריצים קטנים במסגרת הדבקה (עם דבק cyanoacrylate) של נבל מיתרים לאפשר לסכום ירידה של לחץ על הפרוסה כדי לעזור לשמור על שלמות פרוסה (ראו איור 1). על ידי שימוש בשלושה ממדי הדפסה, אנו מסוגלים נבלי עיצוב מותאמים אישית למפרטים שלנו הייחודיים, כמו גם גשרים המאפשרים זרימה אידיאלית של נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) מעל ומתחת לרקמה. זה גם שומר על שטחים גדולים לאור לחדור לרקמות לאלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.
Materials
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100x15mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35x10mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
References
- Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse. J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).
- Agmon, A., Connors, B. Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro. Neuro. 41, 365-379 (1991).
- Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro. J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).
- Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. PNAS. 107, 372-377 (2010).
- MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. A visual thalamocortical slice. Nat meth. 3, 129-134 (2006).
- Crabtree, J. W., Isaac, J. T. New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus. J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).
- McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons. J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).
- Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat. J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).
- Zikopoulos, B., Barbas, H. Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms. J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).
- Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal. Neuron. 38, 529-545 (2003).
- Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus. J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).
- Ehret, G. Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning. Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).
- Mikaelian, D., Ruben, R. Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy. Acta. 59, 451-461 (1965).
