A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

Summary

O uso de vários ângulos para cortar o cérebro do rato filhote, podemos melhorar em cima de uma fatia cerebral aguda anteriormente descrito que captura as conexões entre a maioria dos principais mesencéfalo e prosencéfalo estruturas auditivas.

Abstract

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice¹, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Introduction

No sistema auditivo, embora não haja processamento substancial de informação entre a periferia sensorial e colículo inferior, existe uma considerável processamento adicional antes que ela atinja o córtex auditivo. Sabemos muito pouco sobre como esse processamento é feito e, portanto, pouco sobre como essa transformação permite que o cérebro para interpretar informação sensorial recebida. Com a excepção do olfacto, cada um dos sentidos tem uma estrutura muito semelhante com sinais periféricos inicialmente ser retransmitido com alta fidelidade, que diminui à medida que o sinal sobe para o córtex. O córtex, em seguida, envia projecções para as estruturas inferiores para modular ainda mais a informação recebida. Este sistema complexo tem sido estudada numa variedade de maneiras in vivo, bem como em um número de preparações in vitro. No primeiro caso, todas as ligações estão intactas, permitindo que o pesquisador sondar qualquer conjunto de ligações, enquanto se controla a entrada sensorial e medindosaída em qualquer área. Com essa abordagem, há pouco ou nenhum controlo da grande variedade de outros factores de produção, incluindo outras entradas sensoriais, excitação e atenção, dando origem a uma produção intensamente complexo. In vitro, fatias de cérebro foram cortados para capturar um único set de projecções, ou duas áreas do cérebro ligadas, que permitem que pesquisadores para estimular e avaliar vários aferentes ou áreas do cérebro. Estes são muitas vezes fatias quer talamocorticais ou tectothalamic onde quer a entrada para o tálamo ou no tálamo e sua saída para o córtex são preservados ^2-5. Estas preparações permitem uma ampla variedade de manipulações farmacológicas, elétricas e optogenética. No entanto, com apenas duas regiões do cérebro, que avaliam principalmente à transferência de informações e falta a capacidade de avaliar a transformação de informação à medida que passa através do tálamo. Além disso, a projecção reticulo-tálamo, o que pode jogar um papel na modulação da atenção é ^6-9 PRESENT nesta fatia. Aqui demonstramos melhorias sobre nossa preparação anterior ^{1, que} permite o controle investigador de várias entradas para o tálamo para dar uma perspectiva única de como os portões tálamo e filtros de informação. Nós casal Esta preparação fatia romance com imagens flavoprotein autofluorescência para avaliar a conectividade fatia e análise de ativação de grande escala, a imagem latente de cálcio no tálamo para análise da população neuronal, e gravação de uma única célula para medir o impacto das várias entradas em um nível única célula.

Para auxiliar na manutenção destas ligações generalizadas nós também têm desenvolvido uma série de modificações do âncora fatia normal (aka "harpa") para a realização da fatia do cérebro no lugar e uma ponte para elevar a fatia para maior perfusão. A harpa é projetado em forma de ferradura modificado para cercar a fatia e permitir a pontos de fixação personalizáveis ​​para as cordas da harpa. Três cordas sãoligado de tal modo que i) um encontra-se horizontalmente ao longo do bordo medial da fatia, ii) estende-se a partir da extremidade caudal do IC para a extremidade caudal do CA e iii) estende-se na diagonal a partir do bordo medial da fatia para uma área rostral à AC (ver Figura 1A). Pequenos recortes no quadro para colagem (com cola de cianoacrilato) de harpas cordas para permitir uma diminuição da quantidade de pressão sobre a fatia para ajudar a manter a integridade da fatia (ver Figura 1B). Ao usar a impressão tridimensional, somos capazes de harpas de design personalizado com as nossas especificações únicas, bem como pontes que permitem o fluxo ideal de artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) acima e abaixo do tecido. Isso também mantém grandes áreas para a luz para penetrar no tecido para patch-clamp eletrofisiologia.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade de Illinois. Todos os animais foram alojados em instalações de cuidados de animais aprovados pela Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care. Foi feito todos os esforços para minimizar o número de animais utilizados e reduzir o sofrimento em todas as fases do estudo. 1. Preparação e Remoção de cérebro de rato para Cortando Prepare-se para p…

Representative Results

Um exemplo de fatia de cérebro de ratinho colliculo-talamocortical obtido em P15 rato é mostrada na Figura 2. A fatia ideal irá conter os quatro principais estruturas auditivas do mesencéfalo e do prosencéfalo IC, MGB, TRN, e AC, que são activados quando o IC é estimulada (Figura 2A). Usando a análise de Fourier, o poder espectral é medido na frequência de estimulação elétrica, com regiões do cérebro ligadas mostrando atividade que é periódica e arrasta…

Discussion

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system¹. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to…

Materials

High sucrose cutting solution			in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
Large culture dish	Fisherbrand	08-757-13	100x15mm culture dish
Small culture dish	Falcon	353001	35x10mm culture dish
Raised culture membrane	Millicell	PICMORG50	Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube	Olympus	UMNIB	470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube	Omega Optical	BX-18	XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission
Agar for blocking brain			3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems