Модификация Colliculo-таламокортикального мозга мыши фрагмент, включающий 3-D печать палаты компонентов и нескольких масштаб оптических изображений
Summary
Использование нескольких углов, чтобы сократить мыши щенок мозг, мы совершенствуем ранее описанной острой мозговой срез, который захватывает связи между наиболее крупных слуховых среднего мозга и переднего мозга структур.
Abstract
The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.
Introduction
В слуховой системы, хотя есть существенная переработка информации между сенсорной периферии и нижней бугорок, существует значительная дополнительная обработка, прежде чем он достигнет слуховую кору. Мы очень мало знаем о том, как, что обработка выполняется и поэтому немного о том, как эта трансформация позволяет мозгу интерпретировать входящий сенсорную информацию. За исключением обоняния, каждый из органов чувств имеет очень похожий организации с периферийными сигналов первоначально ретранслируется с высокой точностью, которая падает, как сигнал восходит к коре. Кора затем посылает проекции на нижних структур для дальнейшего модулировать поступающую информацию. Эта сложная система была изучена в различных формах в естественных условиях, а также в ряде препаратов в пробирке. В первом, все соединения целы, что позволяет исследователю зонд любой набор соединений, в то время как управление сенсорного ввода и измеренияВыход в любой данной области. При таком подходе, есть немного, чтобы не контролем большого разнообразия других входов, в том числе других сенсорных входов, возбуждение, и внимание, давая начало интенсивно сложной продукции. В пробирке, кусочки мозга были сокращены, чтобы захватить либо единый набор проекций, или двух областях мозга, связанных, которые позволяют исследователям, чтобы стимулировать и оценивать различные афферентные или участки мозга. Они часто либо таламокортикальных или tectothalamic ломтики где либо вход в таламус или таламус и его выход к коре сохранились 2-5. Эти препараты позволяют для широкого спектра фармакологических, электрических и optogenetic манипуляций. Однако только два областей мозга, они в первую очередь оценить передачу информации и не имеют возможности оценить преобразования информации, как она проходит через таламус. Также ретикуло-таламических проекция, которая может играть роль в модуляции внимания 6-9 является прESENT в этом срезе. Здесь мы показываем, улучшения на основании нашего предыдущего подготовки 1, что позволяет контролировать следователя различных входов в таламус, чтобы дать уникальную перспективу, как таламус ворот и фильтров информации. Мы пара этот роман подготовка кусочек с изображениями флавопротеидом автофлуоресцентной для оценки связи ломтик и активационный анализ масштабную, визуализации кальция в таламусе для нейронов анализа населения, и запись одной ячейки для измерения влияния различных входов на одном уровне клетки.
Для оказания помощи в поддержании этих широко распространенных соединений мы также разработали ряд модификаций нормального среза якоря (ака "арфы") для проведения кусочек мозга в месте и мост, чтобы поднять кусочек для повышения перфузии. Арфа предназначен в модифицированной форме подковы, чтобы окружить кусочек и позволяют настраиваемых точек крепления для струн арфы. Три струныприкреплена таким образом, что I) одним лежит горизонтально вдоль медиального края среза, II) одним простирается от каудальной кромке IC к каудальной кромке AC и III) одним простирается по диагонали от медиального края среза в область ростральнее АС (рис 1А). Небольшие вмятины в кадре для склеивания (с цианакрилатного клея) арфы струны позволяют за снижение количества давления на срезе, чтобы помочь сохранить целостность ломтик (рис 1B). С помощью трехмерной печати, мы можем пользовательских арф дизайна для наших уникальных характеристик, а также мостов, которые позволяют идеального течения искусственного спинномозговой жидкости (ACSF) выше и ниже ткани. Это также поддерживает большие площади для света проникать в ткани для патч зажим электрофизиологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.
Materials
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100x15mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35x10mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
References
- Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse. J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).
- Agmon, A., Connors, B. Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro. Neuro. 41, 365-379 (1991).
- Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro. J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).
- Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. PNAS. 107, 372-377 (2010).
- MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. A visual thalamocortical slice. Nat meth. 3, 129-134 (2006).
- Crabtree, J. W., Isaac, J. T. New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus. J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).
- McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons. J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).
- Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat. J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).
- Zikopoulos, B., Barbas, H. Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms. J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).
- Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal. Neuron. 38, 529-545 (2003).
- Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus. J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).
- Ehret, G. Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning. Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).
- Mikaelian, D., Ruben, R. Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy. Acta. 59, 451-461 (1965).
