Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

Summary

El uso de múltiples ángulos para cortar el cerebro pup ratón, mejoramos sobre una rebanada cerebral agudo descrito previamente-que captura las conexiones entre la mayoría de las principales estructuras del mesencéfalo y el prosencéfalo auditivas.

Abstract

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice¹, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Introduction

En el sistema auditivo, aunque hay una transformación sustancial de información entre la periferia sensorial y el colículo inferior, hay una considerable procesamiento adicional antes de que alcance la corteza auditiva. Sabemos muy poco acerca de cómo ese proceso se hace y por lo tanto poco acerca de cómo esa transformación permite que el cerebro interpreta la información sensorial entrante. Con la excepción del olfato, cada uno de los sentidos tiene una organización muy similar con señales periféricas inicialmente siendo retransmitido con alta fidelidad que disminuye a medida que la señal asciende a la corteza. La corteza envía proyecciones a las estructuras inferiores para modular aún más la información entrante. Este complejo sistema ha sido estudiado en una variedad de maneras in vivo, así como en un número de preparaciones in vitro. En el primero, todas las conexiones están intactas, lo que permite al investigador para investigar cualquier conjunto de conexiones, mientras que el control de la entrada sensorial y la medición desalida en un área determinada. Con este enfoque, hay poco o ningún control de la gran variedad de otros insumos, incluyendo otros estímulos sensoriales, la excitación y la atención, dando lugar a una salida intensamente compleja. In vitro, rodajas de cerebro han sido cortadas para capturar ya sea un único conjunto de las proyecciones, o dos áreas cerebrales conectados, que permiten a los investigadores para estimular y evaluar los aferentes o áreas cerebrales diferentes. Estos son a menudo ya sea rebanadas thalamocortical o tectothalamic donde ya sea la entrada al tálamo o el tálamo y su salida a la corteza se conservan ^2-5. Estas preparaciones permiten una amplia variedad de manipulaciones farmacológicas, eléctricas y optogenética. Sin embargo, con sólo dos regiones del cerebro, que evalúan principalmente la transferencia de información y carecen de la capacidad de evaluar la transformación de la información a medida que pasa a través del tálamo. También la proyección retículo-talámico, que puede desempeñar un papel en la modulación de la atención ^6-9 es prESENT en este segmento. Aquí se demuestra mejoras sobre nuestra preparación previa ^1, que permite el control investigador de varias entradas al tálamo para dar una perspectiva única de cómo las puertas tálamo y filtros de información. Nos pareja esta nueva preparación rebanada con imágenes de autofluorescencia flavoproteína para evaluar la conectividad rebanada y el análisis de activación a gran escala, imágenes de calcio en el tálamo para el análisis de la población neuronal, y la grabación de una sola célula para medir el impacto de las diversas entradas en un solo nivel celular.

Para ayudar en el mantenimiento de estas conexiones generalizadas también hemos desarrollado una serie de modificaciones del ancla rebanada normal (también conocido como "arpa") para la celebración de la corte de cerebro en su lugar y un puente para elevar la rebanada para mejorar la perfusión. El arpa está diseñado en forma de herradura modificada para rodear el corte y permitir puntos de fijación personalizables para las cuerdas del arpa. Tres cadenas sonadjunta de tal manera que i) se tiende horizontalmente a lo largo del borde medial de la rebanada, ii) Se extiende desde el extremo caudal del IC hasta el extremo caudal de la AC y iii) un extiende diagonalmente desde el borde medial de la rebanada a un área rostral a la AC (ver Figura 1 A). Muescas pequeñas en el marco de pegar (con pegamento de cianoacrilato) del arpa cadenas permiten una disminución en la cantidad de presión sobre el sector para ayudar a mantener la integridad de la rebanada (véase la Figura 1B). Mediante el uso de la impresión tridimensional, somos capaces de arpas de diseño personalizado a nuestras especificaciones únicas, así como los puentes que permiten el flujo ideal de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) encima y debajo del tejido. Esto también mantiene grandes áreas de luz para penetrar en el tejido de la electrofisiología de pinzamiento zonal.

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Illinois. Todos los animales fueron alojados en las instalaciones de cuidado de los animales aprobados por la Asociación Americana para la Acreditación del Laboratorio Animal Care. Cada intento se hizo para reducir al mínimo el número de animales utilizados y reducir el sufrimiento en todas las etapas del estudio. 1. Preparación y Extracción de cerebro de ratón para r…

Representative Results

Un ejemplo de cortes de cerebro de ratón colliculo talamocortical obtenido en P15 ratón se muestra en la figura 2. El corte ideal deberá contener los cuatro grandes estructuras auditivas del cerebro medio y cerebro anterior IC, MGB, TRN, y CA, los cuales están activados cuando el IC es estimulada (Figura 2A). Utilizando el análisis de Fourier, la potencia espectral se mide en la frecuencia de estimulación eléctrica, con las regiones del cerebro que muestran conec…

Discussion

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system¹. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to…

Materials

High sucrose cutting solution			in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
Large culture dish	Fisherbrand	08-757-13	100x15mm culture dish
Small culture dish	Falcon	353001	35x10mm culture dish
Raised culture membrane	Millicell	PICMORG50	Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube	Olympus	UMNIB	470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube	Omega Optical	BX-18	XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission
Agar for blocking brain			3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems