Elektro på Isolerade hjärnstammen-ryggmärgen Förberedelser från nyfödda Gnagare Tillåter Neural Respiratory Network Output inspelning

Summary

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Abstract

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

Introduction

Andning är en komplex och viktig näring styrs av hjärnan, vilket gör dioxygen (O ₂₎ upptag och koldioxid (CO ₂₎ eliminering. Den centrala andningsdrift genereras av ett komplext nätverk som ligger i hjärnstammen i både däggdjur ^1, amfibier ^2, reptiler ^3, fåglar ^{4 och} fiskar ^5. Även om studien av andning kan bearbetas in vivo, precisa mekanistiska undersökningar kräver direkt tillgång till andningsnätverksstyrning. För detta ändamål, Adrian och Buytendijk utvecklat en reducerad beredning guldfisk, där elektroder placeras på hjärnstammen ytan posten den genererade rytmen i samband med gill ventilation ^5. Detta tillvägagångssätt anpassades därefter av Suzue 1984 ⁶ för användning hos nyfödda gnagare. Tillkomsten av detta preparat har lett till betydande framsteg i andnings neurobiologi. Eftersom det är relativt enkelt, den teknik som presenteras here är mottaglig för ett brett spektrum av grundläggande undersökningar av rytmiska motor beteenden och deras ursprung hos nyfödda gnagare.

Det övergripande målet med denna metod är att registrera neurala korrelat av inandnings aktivitet, en så kallad andningsliknande rytm fiktiva andning, som produceras av andnings nätverket. Denna metod kan användas i ett brett spektrum av forskningsmålen, med inriktning inandnings svar på respiratoriska variationer eller farmakologi i både vilda typ ⁷ och transgena ⁸ djur. Med tanke på att experimenten utförs vid låg temperatur, utan sensoriska afferenter, och under förhållanden där koncentrationerna av glukos och _O2 inom aCSF är höga, har frågor väckts om den fysiologiska relevansen av signalen registreras. Även om det finns tydliga skillnader mellan in vivo och in vitro-förhållanden (t.ex.., Frekvensen av inandnings skurar) kvarstår det faktum att förekomsten avde centrala delarna av andnings nätverket ⁶ gör det möjligt att studera en robust rytm associerad med en vital homeostatisk funktion ^9,10.

Den logiska grunden bakom utvecklingen och användningen av denna teknik är att underlätta direkt tillgång till hjärnstammen elementen i andnings nätverket, som är knappast tillgängliga in vivo, speciellt i nyfödda. Hjärnstammen placeras under strängt kontrollerade betingelser: den inspelade rytm inte moduleras av perifera afferenta input från lungorna eller hals organ, vilket gör studien att fokusera på central andnings själva enheten ^11. Således är denna tillgång utnyttjas för att tillämpa stimuli och registrera utsignalen. I motsats till pletysmografi inspelningar, är andningsrytm modul av alla dess komponenter i hela kroppen (t ex., Lung buk, perifera kemosensorer), vilket gör det svårt att tillämpa exakta stimuli.

I enewborn råtta, protokollet består av registrering av fjärde ventrala roten signal på en isolerad hjärnstam och en stympad ryggmärg, hålls i artificiell cerebrospinalvätska (aCSF). Rytmen genereras av hjärnstammen-ryggmärgen förberedelser består av enskilda långsamma skurar som är kopplade till inandnings signalen ^9. Isolerade hjärnstammen-ryggmärg preparat lätt inspelningsbara hos råttor från postnatal dag 0-4 (P0 – P4) ^7. Denna metod används ofta för att utvärdera den hypoxiska svaret hos andnings nätverket och också svaret på hyperkapni, acidos eller droger. En akut syrebrist protokollet presenteras här. Denna stimulering erhålles genom indragning av O ₂ i aCSF; denna metod används ofta för att bedöma tolerans och lyhördhet för hypoxiska förolämpningar. Protokollet inducerar en rytm depression från första minuten till slutet av hypoxi exponering (Figur 1) ^12. Denna fördjupning är omvändunder efter hypoxisk återhämtning ^12. När det gäller experimentell design, är det viktigt att märka att pons, som ligger vid den rostrala delen av hjärnstammen, har en hämmande verkan på rytmgeneratorn ^8. Således, beredningar av hela hjärnstammen och rostralt ryggmärgen visa ett lägre rytm. Inkludering av hjärnbryggan i det isolerade provet för inspelningen bestäms enligt målet av experimentet ^13; studiet av pontina inflytande på förlängda märgen nätverket skulle kräva inspelningar med och utan pons att jämföra resultaten ^14. Dessutom är en av fördelarna med denna teknik möjligheten att utvidga rostralt del av förberedelserna för att inkludera mesencefal och / eller diencephalic regioner ^15,16, vilket gör det möjligt att bedöma effekten av dessa regioner på ponto-medullär andnings nätverk.

Protocol

Denna metod kräver användning av djurpatienter, tillåts av Laval University Animal etikkommitté (protokoll # 2012-170). 1. Inställningar och förberedelse Lösningar Bered aCSF stamlösningar i enlighet med följande recept 7,17. Andra recept med variationer koncentrations finns i litteraturen. Butiksstamlösningar vid 4 ° C i upp till en månad. Salt lösning: tillsätt 75,39 g NaCl (129 mM slutlig); 2,5 g KCl (3,35 mM slutlig); 0,81 g Na…

Representative Results

Såsom nämndes i inledningen, är en av de viktigaste fördelarna med denna teknik den direkt tillgång till hjärnstammen att tillämpa olika stimuli. Som ett exempel, var hypoxi tillämpas här. Figur 1. AB uppvisar en komplett protokoll inspelning, med både normoxiska och hypoxiska förhållanden. Figur 1.CE visar rytmen inspelad i normoxiska förhållanden (dvs, aCSF bubblade med 95% O2 och 5% CO2 vid 26 ° C). Såsom tidigare visats i denna specifik…

Discussion

Exakt kvantifiering av andningsaktivitet kan vara en utmaning. I själva verket är andningen en funktion som kan vara både automatisk och frivilliga, och det regleras i enlighet med miljön, kroppens behov, känslomässiga tillstånd och beteende. Fördelen med denna teknik är isoleringen av de neurala element som är ansvariga för att producera respirations kommandot. Således, elektrofysiologiska inspelningar av hjärnstammen-ryggmärgen förberedelser och pletysmografi är kompletterande tekniker för att studera…

Materials

Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Use under hood
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-glucose	Bioshop	GLU501
Carbogen	Linde	343-02-0006
Temperature Controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Suction electrode	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 573000
Differential AC amplifier	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 1700
Moving averager	CWE, Ardmore, PA, USA	model MA-821
Data acquisition system	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	model DI-720
LabChart software	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware	Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber	Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber	Home made
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	KITE-R
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	MINIPULS 3
Faraday Cage	Home made
Computer