Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
Fraîchement isolés cellules endothéliales spécifiques de tumeurs (TEC) peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de l'angiogenèse tumorale et servir comme un modèle in vitro pour le développement de nouveaux inhibiteurs de l'angiogenèse pour le cancer. Cependant, à long terme dans l'expansion in vitro des cellules endothéliales murines (CE) est difficile en raison de la dérive phénotypique dans la culture (de transition endothéliale-à-mésenchymateuses) et la contamination avec des non-CE. Cela est particulièrement vrai pour TEC qui sont facilement surpassés par les fibroblastes co-purifié ou des cellules tumorales en culture. Ici, une méthode d'isolement de haute fidélité qui tire parti de l'enrichissement immunomagnétique couplée avec la sélection de la colonie et dans l'expansion in vitro est décrite. Cette approche génère des fractions pures CE qui sont entièrement libres de contaminer les cellules stromales ou tumorales. Il est également démontré que la lignée tracée Cdh5-cre: / l de souris rapporteurs de ZsGreen l /, utilisés avec le protocole décrits ici, sont un outil précieux pour vérifier cellulairela pureté que les colonies isolées CE de ces souris montrent durable et brillante fluorescence ZsGreen dans la culture.
Introduction
Les cellules endothéliales (CE) sont essentiels lors du développement de tumeurs solides. De l'initiation du switch angiogénique dans les tumeurs dormantes à la diffusion et l'ensemencement des métastases à des sites distants, CE former les conduits qui fournissent du sang, de l'oxygène et de nutriments pour soutenir la croissance de la tumeur 1. Comme suggéré récemment, EC ont aussi des fonctions de perfusion indépendantes et former une niche qui prend en charge la croissance des cellules souches cancéreuses et d'autres cellules du stroma de la tumeur 2-5. Ainsi, hautement purifié CE (TCE) pour la culture in vitro spécifique de la tumeur permet études fonctionnelles de routine qui va faire la lumière sur les mécanismes moléculaires de médiation angiogenèse tumorale et la diaphonie avec des cellules tumorales.
CE sont très spécialisés en fonction du tissu d'origine 6. En raison de la nature hétérogène de différents types de tumeurs et le microenvironnement de la tumeur, TEC peut également afficher des caractéristiques uniques qui reflètent une tumeur spécifique à la spécialisation of le système vasculaire. Par exemple, il existe une variabilité frappante dans les signatures d'expression génique dans TEC isolés à partir de différents types ou classes de tumeurs 7,8. Toutefois, fréquemment co-purification de non-CE, en particulier les fibroblastes associés à une tumeur et les cellules tumorales, avec TEC peut confondre analyses d'expression du génome entier. Ces types de cellules non désirées sont particulièrement problématiques dans les études qui reposent sur le long terme dans l'expansion in vitro de cultures de TEC.
Décrit ici est un procédé haute-fidélité qui produit toujours des cultures pures CE de tumeurs et d'autres tissus. Suite à l'enrichissement immunomagnétique des fractions de la CE et l'élimination des co-purifié non-CE colonne, une étape clonage torique supplémentaire pour capturer colonies CE pur est utilisé 9. Chaque colonie peut être étendue en culture pendant plusieurs passages sans l'émergence de contamination non-CE. Cette méthode donne également de multiples clones CE d'une procédure d'isolement unique, ce qui est idéal pour l'étude de l'endohétérogénéité épithélial. En outre, il est démontré que Cdh5 CRE: les souris rapporteurs / l de ZsGreen l / sont un outil précieux pour générer CE "de sort-mappé" et indélébile marqué qui maintiennent ZsGreen fluorescence dans la culture 10. Avec quelques ajustements mineurs au protocole, cette méthode devrait être adaptable à différents types de tumeurs ou de tissus normaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison des difficultés à obtenir des cultures de TEC primaires pures, dont beaucoup dans des études in vitro TEC substitut avec des lignes disponibles dans le commerce de la CE ou primaire CE tels que la veine ombilicale humaine CE (HUVEC) 13. Cependant, ces populations CE de tissus normaux ne peuvent servir de proxy pour les TEC qui diffèrent sensiblement de leurs homologues normales. Par exemple, TEC sont phénotypiquement et fonctionnellement anormale in vivo et certains de ces ano…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
References
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