We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
हौसले से पृथक ट्यूमर विशिष्ट endothelial कोशिकाओं (टीईसी) ट्यूमर angiogenesis के आणविक तंत्र का पता लगाने और कैंसर के लिए नई एंजियोजिनेसिस अवरोधकों को विकसित करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, murine endothelial कोशिकाओं (ईसी) की इन विट्रो विस्तार में लंबी अवधि के न होने के कारण चुनाव आयोग के साथ प्ररूपी संस्कृति में बहाव (एन्दोथेलिअल करने वाली mesenchymal संक्रमण) और संदूषण के लिए चुनौतीपूर्ण है। यह आसानी से संस्कृति में सह-शुद्ध fibroblasts या ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा outcompeted रहे हैं, जो टीईसी के लिए विशेष रूप से सच है। इधर, कॉलोनी चयन के साथ और इन विट्रो विस्तार में युग्मित immunomagnetic संवर्धन का लाभ लेता है कि एक उच्च निष्ठा अलगाव विधि वर्णित है। यह दृष्टिकोण स्ट्रोमल या ट्यूमर कोशिकाओं को दूषित की पूरी तरह से स्वतंत्र हैं कि शुद्ध चुनाव आयोग अंशों उत्पन्न करता है। यह भी कि वंश का पता लगाया Cdh5 रचनात्मक दिखाया गया है: प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया ZsGreen एल / एस / एल संवाददाता चूहों, यहाँ बताया, सेल सत्यापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैंइन चूहों से अलग चुनाव आयोग कालोनियों के रूप में पवित्रता संस्कृति में टिकाऊ और प्रतिभाशाली ZsGreen प्रतिदीप्ति दिखा।
Endothelial कोशिकाओं (ईसी) ठोस ट्यूमर के विकास के दौरान आवश्यक हैं। प्रचार-प्रसार और दूर साइटों पर मेटास्टेसिस के बोने के लिए निष्क्रिय ट्यूमर में वाहिकाजनक स्विच की दीक्षा से, चुनाव आयोग ट्यूमर के विकास को एक बनाए रखने के लिए रक्त, ऑक्सीजन प्रदान करते हैं कि नाली, और पोषक तत्वों के रूप में। हाल ही में सुझाव दिया है, चुनाव आयोग भी छिड़काव स्वतंत्र कार्य किया है और कैंसर स्टेम कोशिकाओं और अन्य ट्यूमर stromal कोशिकाओं 2-5 के विकास का समर्थन करता है कि एक आला के रूप में। इस प्रकार, अत्यधिक ट्यूमर विशिष्ट इन विट्रो संस्कृति के लिए चुनाव आयोग (टीईसी) ट्यूमर angiogenesis और ट्यूमर कोशिकाओं के साथ पार बात मध्यस्थता उपन्यास आणविक तंत्र पर प्रकाश डाला जाएगा कि दिनचर्या कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है शुद्ध।
चुनाव आयोग मूल 6 के ऊतक के आधार पर उच्च स्तरीय विशेषज्ञ हैं। कारण अलग ट्यूमर प्रकार की विषम प्रकृति और ट्यूमर microenvironment करने के लिए, टीईसी भी एक ट्यूमर विशिष्ट विशेषज्ञता ओ प्रतिबिंबित अद्वितीय विशेषताएं है कि प्रदर्शित कर सकता हैवाहिका च। उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रकार या ट्यूमर 7.8 के ग्रेड से अलग टीईसी में जीन की अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों में हड़ताली परिवर्तनशीलता है। हालांकि, टीईसी के साथ गैर-चुनाव आयोग, विशेष रूप से ट्यूमर जुड़े fibroblasts और ट्यूमर कोशिकाओं, के लगातार सह-शुद्धि जीनोम चौड़ा अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है उलझाना कर सकते हैं। इन अवांछित सेल प्रकार टीईसी संस्कृतियों के इन विट्रो विस्तार में लंबी अवधि पर निर्भर है कि पढ़ाई में विशेष रूप से समस्याग्रस्त हैं।
यहाँ वर्णित लगातार ट्यूमर और अन्य ऊतकों से शुद्ध चुनाव आयोग संस्कृतियों का उत्पादन एक उच्च निष्ठा विधि है। चुनाव आयोग भिन्न और सह शुद्ध गैर-चुनाव आयोग को हटाने की immunomagnetic स्तंभ संवर्धन के बाद, एक अतिरिक्त क्लोनिंग अंगूठी चरण 9 प्रयोग किया जाता है शुद्ध चुनाव आयोग कालोनियों पर कब्जा करने के लिए। प्रत्येक कॉलोनी गैर चुनाव आयोग को दूषित के उद्भव के बिना कई मार्ग के लिए संस्कृति में विस्तार किया जा सकता है। इस विधि को भी एंडो के अध्ययन के लिए आदर्श है जो एक भी अलगाव की प्रक्रिया से कई चुनाव आयोग क्लोन पैदावारthelial विविधता। ZsGreen एल / एस / एल संवाददाता चूहों संस्कृति 10 में ZsGreen प्रतिदीप्ति बनाए रखने के जो "भाग्य-मैप" और पक्केपन से चिह्नित चुनाव आयोग पैदा करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं: इसके अलावा, यह Cdh5 रचनात्मक कि दिखाया गया है। प्रोटोकॉल को मामूली समायोजन के साथ, इस विधि अलग ट्यूमर प्रकार या सामान्य ऊतकों के लिए अनुकूल होना चाहिए।
कारण शुद्ध प्राथमिक टीईसी संस्कृतियों, ऐसे मानव नाल की नस चुनाव आयोग (HUVEC) के रूप में 13 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुनाव आयोग लाइनों या प्राथमिक चुनाव आयोग के साथ इन विट्रो अध्ययन में कई स्थानाप?…
The authors have nothing to disclose.
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
Sterile water | – | – | |
Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
6-well tissue culture plates | Corning | – | |
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
Fine-tip marker | – | – | |
Hemocytometer | – | – | |
LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
Tissue culture hood | – | – | |
Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
Liquid nitrogen freezer | – | – | |
Microplate or rotary shaker | – | – | |
Phase contrast light microscope | – | – |