Kontraktilitet Målinger på isolerede papillærmuskler for undersøgelse af Cardiac inotropi i mus
Summary
Murint venstre ventrikel papillær muskel kan anvendes til at undersøge hjertets kontraktilitet in vitro. Denne artikel beskriver i detaljer isolation og forsøgsprotokoller til at studere hjerte-kontraktile egenskaber.
Abstract
Papillærmuskel isoleret fra voksne mus hjerter kan anvendes til at studere hjertets kontraktilitet under forskellige fysiologiske / patologiske tilstande. De kontraktile egenskaber kan vurderes uafhængigt af ydre påvirkninger såsom vaskulær tonus eller neurohumorale status. Det forestiller en videnskabelig tilgang mellem enkelt celle målinger med isolerede hjertemyocytter og in vivo studier som ekkokardiografi. Således papillærmuskel præparater tjene som en glimrende model til at studere hjertets fysiologi / patofysiologi og kan anvendes til undersøgelser som modulationen af farmakologiske midler eller udforskning af transgene dyremodeller. Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af murine venstre forreste papillærmuskel at undersøge hjertets kontraktilitet i et organbad setup. I modsætning til en muskelstrimlen præparat isoleret fra den ventrikulære væg, kan papillærmusklen fremstilles i toto uden at beskadige musklen tissue alvorligt. Organbadet setup består af flere temperaturkontrollerede, gasset og elektrodernes udstyret organbad kamre. Det isolerede papillarmuskel er fastgjort i organbadet kammeret og elektrisk stimuleret. Den fremkaldte twitch kraft registreres ved hjælp af en tryktransducer og parametre såsom spjæt kraftamplituden og spjæt kinetik analyseres. Forskellige forsøgsprotokoller kan udføres for at undersøge calcium- og frekvensafhængig kontraktilitet samt dosisresponskurver af kontraktile midler, såsom katekolaminer eller andre lægemidler. Derudover kan patologiske tilstande som akut iskæmi simuleres.
Introduction
Undersøgelsen af proteiner som ionkanaler henviser deres rolle for hjerte-kontraktilitet er afgørende for at opdage forskellige patomekanismer og fastsætte nye terapeutiske strategier for hjertesygdomme såsom iskæmi og hjertesvigt.
Kontraktile funktion af mammale cardiomyocytter vides at blive moduleret af forskellige ionkanaler, transportører og andre proteiner. Potentiel handling fremkaldt aktivering af spænding afhængig sarcolemmal L-typen Ca 2 + kanaler fører til Ca2 + indstrømning fra ekstracellulære rum og senere til Ca 2 + induceret Ca 2+ frigivelse (CICR) 1, som udløser cellulære 2 sammentrækning. Ca 2+ -signaling spiller en central rolle i hjertets sammentrækningsevne og tilpasning til fysiologisk eller patologisk stress. Katekolaminer aktiverer hjerte- p-adrenerge receptorer og derved stimulere adenylylcyklase (AC), som syntetiserer cAMP. Aktiveres, Protein kinase A (PKA) phosphorylerer forskellige intracellulære og membran associerede proteiner ligesom L-type Ca 2 + kanaler, phospholamban og ryanodine receptorer resulterer i ændring af Ca 2 + transienter og hjerte-kontraktilitet 1,3,4. cAMP nedbrydes af phosphodiesterase (PDE). Aktivering af andre end p-adrenoceptorer Gs-koblede receptorer fører også til akkumulering af cAMP.
Teknikken med kontraktilitet målinger i isolerede ventrikulære muskelstrimler er veletableret for større pattedyrarter 5-8. Baseret på muligheden for gen-targeting i mus er det vigtigt at etablere metoder til at analysere murine cardiac fysiologi. Men eksisterende data om de fysiologiske egenskaber af isolerede præparater muskel i mus varierer afhængigt af eksperimentelle betingelser 9-12.
Den beskrevne metode anvendes til at analysere hjertets kontraktilitet af venstre ventrikels papillærmuskel prepræparater in vitro. Undersøgelse af hjertets kontraktilitet udføres i fravær af påvirkninger ændring hjertets kontraktilitet in vivo, ligesom blodtryk, neurohumoral stimulering og fysisk eller metabolisk stress. Den bankende sats for den ordregivende muskel præparat kan strengt defineres og ændres vilkårligt. Spjæt kraft kan analyseres i sammenhæng med specifikke stimuli såsom calcium koncentration, slå frekvens eller temperatur. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at undersøge forskellige signalvej komponenter, og at sammenligne hjertets funktion af genetisk modificerede musemodeller ved at styre eksperimentelle betingelser nævnt ovenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en fremgangsmåde til at undersøge kontraktilitet murine papillarmuskel in vitro, som kan bruges til at besvare en række videnskabelige spørgsmål i forbindelse med hjerte fysiologi og patologi hos mus samt at støtte analysen af transgene linier og opdagelsen af nye farmaceutiske metoder til behandling af hjerteproblemer dysfunktioner. Vi illustrerer anvendelsen af denne metode til at vurdere fysiologiske, patologiske og farmakologiske egenskaber af hjertemusklens kontraktili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Ombygning-Prozessen", FR 1638 / 1-2) og af DZHK (tysk center for Cardiovascular Research, en del af de tyske Centres of Health Research , som er en BMBF (tyske ministerium for uddannelse og forskning) initiativet).
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Hazard statement H312, solve in DMSO |
| 3-?Isobutyl-?1-?methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Hazard statement H 302, solve in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Hazard statement H 315-H319-H335 |
| Sodium Heparine 250.000 IE/10ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335 |
References
- Endoh, M. Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers. Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Bers, D., Despa, S. M. Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response. Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).
- Bers, D. M. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
- Pieske, B., et al. al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium. Basic Res Cardiol. 92, 75-86 (1997).
- Corbin, J. Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart. Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).
- Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip. Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).
- Näbauer, M., et al. Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts. Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).
- Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle. J Physiol. 507, 175-184 (1998).
- Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).
- Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type. Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).
- Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice. JMCC. 74, 307-317 (2014).
- Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation. J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).
- Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure. Basic Res Cardiol. 97, 163-171 (2002).
- Koch-Weser, J., Blinks, J. R. The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility. Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).
- Bocalini, D. S. Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay. Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).
- Juggi, J. S. Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart. J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).
- Lakatta, E. G. Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy. Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).
- Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human. Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).
- Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. The force-interval relationship in human myocardium. J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).
- Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3. r. d., Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium. JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).
- Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud. Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).
- Lee, J. A., Allen, D. G. Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle. Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).
