Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen
Summary
This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.
Abstract
Intravitale microscopie is een werkwijze die kan worden gebruikt om verschillende processen in verschillende regio's en schepen in levende dieren te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we intravitale microscopie van mesenterium aderen. Dit kan worden uitgevoerd in een korte tijd met reproduceerbare resultaten tonen leukocyt-endotheel interacties in vivo. We beschrijven een inflammatoire instelling na LPS uitdaging van het endotheel. Maar in dit model kan men veel verschillende soorten van toepassing van inflammatoire aandoeningen, zoals bacteriële, chemische of biologische en onderzoek de toediening van geneesmiddelen en hun directe effecten op het leven van dieren en de impact ervan op leukocyten werving. Dit protocol is met succes toegepast op een aantal verschillende behandelingen muizen en hun effect op ontstekingsreactie in vaten. Hierin beschrijven we de visualisatie van leukocyten en bloedplaatjes door fluorescent labelen die met rhodamine 6G. Bovendien kan een specifieke pe beeldvorming zijnrformed met behulp van gericht fluorescerend gemerkte moleculen.
Introduction
Het doel van dit protocol is een vereenvoudigde methode van intravitale microscopie van mesenterium aderen beschrijven levende muizen directe observatie van leukocyt-endotheel leukocyt en bloedplaatjes interacties onder ontstekingsaandoeningen.
Intravitale microscopie werd ontwikkeld om leukocyt-endotheel interacties in vivo te bestuderen onder ontstekingsaandoeningen 1,2, wat niet triviaal, maar belangrijk voor het begrijpen van inflammatoire leukocyten rekrutering en functie. De werkwijze beschrijven we in dit protocol is ontwikkeld op basis van eerder gepubliceerde publicaties. Soortgelijke visualiseren bloedplaatjes bijmenging in een groeiende trombus 3 en parallel aan wat eerder is gepubliceerd 4, een geëxterioriseerde mesenterium ader wordt onderzocht door doorvallend licht microscopie. Er zijn diverse andere modellen van intra-vitale microscopie zoals de cremaster spier van ratten 5 of lever van muizen en ratten 6.
Intravitale microscopie van mesenterium ader is ontwikkeld en in eerdere studies toegepast door verscheidene groepen. We hebben deze techniek gebruikt om de verschillen in de rekrutering van leukocyten tussen wild type muizen en tryptofaan hydroxylase1 (Tph1) te observeren – / – muizen, die een tekort van niet-neuronale serotonine en vergeleken de resultaten met muizen waarvan de plaatjes serotonine werd farmacologisch uitgeput door de lange termijn zijn de toepassing van de selectieve serotonine heropname remmers fluoxetine 7. We hebben ook onderzocht leukocyten-endotheel interacties na de acute behandeling met fluoxetine 8.
In dit protocol richten we ons op intravitale microscopie van mesenterium aders, omdat dit model snel kan worden uitgevoerd en maakt valide metingen van leukocyt-endotheel en bloedplaatjes-leukocyt interacties. Dit is veel moeilijker en tijdrovender in intravitale microscopie van andere organen, zoals bot, lever, huid of spier cremaster. The model beschreven ideaal voor reproduceerbare beoordeling van inflammatoire interactie cel-cel na challengeing met een inflammatoire stimulus, zoals intraperitoneale injectie van lipopolysaccharide.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschrijven we de voorbereiding en uitvoering van intravitale microscopie van mesenterium aderen van muizen in vivo. Deze methode geeft ons de mogelijkheid om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-endotheel interacties 11 direct waar te nemen in het levende organisme.
Als een vroege reactie op het endotheel ontsteking wordt geactiveerd en interageert met leukocyten en bloedplaatjes resulteert in rollen, adhesie en transmigratie 12. Maar leukocyten ook in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Materials
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
