Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em> In-vitro-</em> Experimental Modell
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
In vitro zweidimensionale (2D) neuronale Netze zu Micro-Elektroden-Arrays (MEAs) gekoppelt arethe Goldstandard angenommen, um das Zusammenspiel von neuronaler Dynamik und der zugrunde liegenden Konnektivität studieren experimentellen Modell. Bei der Entwicklung, Nervenzellen neu zu komplexen Netzwerken, die auch angezeigt werden definedspatio-temporalpatternsof Tätigkeit 1,2 (dh platzt, Netzwerk-Bursts, zufällige spiking Aktivität). MEAs erfassen die elektrophysiologische Aktivität von vielen Websites (von zehn bis Tausende von Mikroelektroden), so dass eine detaillierte Untersuchung der Dynamik zum Ausdruck auf Netzwerkebene. Darüber hinaus ist die Verwendung von dissoziierten Kulturen macht possibile, um technisch-Netzwerke zu entwerfen. Es ist einfacher, auf diese Weise zu verstehen, die funktionalen Beziehungen zwischen dem aufgezeichneten elektrophysiologische Aktivität und die Parameter der Netzwerkorganisation, wie Zelldichte 3 Grad an Modularität 4,5, Gegenwart heterogener neuronalen populations 6 usw. Aber alle in vitro-Studien auf distanzierte kultivierten Zellen werden auf 2D neuronale Netze. Dieser Ansatz führt zu Vereinfachungen in Bezug auf die in vivo (eigen 3-dimensional, 3D-System): (i) in einem 2D-Modell, Somata und Wachstumskegeln sind abgeflacht und die Axone-Dendriten Auswuchs kann nicht in allen Richtungen 7 verbreiten. (ii) 2D-in-vitro-Netzwerke weisen stereoelektrophysiologischen Dynamik durch Platzen Tätigkeit, die die meisten Neuronen des Netzes 8 dominiert.
In jüngster Zeit verschiedene Lösungen entwickelt worden, um die Konstruktion von in-vitro-3D dissoziierten neuronalen Netzen zu ermöglichen. Die gemeinsame Idee besteht in der Schaffung eines Gerüsts, wo Nervenzellen können in einer 3D-Mode wachsen. Ein solches Gerüst kann mit Polymer-Gelen und festen porösen Matrizen 9-13 realisiert werden. Durch Ausnutzung der mechanischen Eigenschaften der Polymere ist es möglich, Zellen in thes einbettene Strukturen durch einen einheitlichen Block von 3D-Kulturen von Neurosphären 11 definieren. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die starre mechanische Eigenschaft der Neurosphären 9,12. Jedoch haben diese Materialien beschränkt Porosität, und sie garantieren nicht die Zellmigration in der Matrix. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist eine mögliche Lösung besteht im Trennen der Matrix in "Einheit" Modulen. Leider konnte die Größe und Form der Partikel Vielfalt Packung in regulären Schichtstrukturen zu behindern. In 7, Cullen und Mitarbeiter entwickelt einen 3D-neuronalen Konstrukt up von Neuronen und / oder Astrozyten innerhalb eines bioaktiven extrazellulären Matrix-basierten Gerüst gemacht. Eine solche konstruiert Nervengewebe in vitro Untersuchungen erlaubt, zu studieren und zu manipulieren neurobiologischen Reaktionen innerhalb von 3D-Mikro-Umgebungen. Dieses Modell besteht aus Neuronen und Gliazellen im gesamten extrazellulären Matrix (ECM) und / oder Hydrogel Gerüste (500-600 & mgr; m dick) verteilt. In dieser Co5000 Zellen / mm 3 – ndition eine optimale Zelllebensfähigkeit (mehr als 90%) wurde durch Ausplattieren Zellen bei einer endgültigen Dichte von ungefähr 3,750 gefunden. Es ist zu beachten, dass eine solche Dichtewert ist viel niedriger als die in der in-vivo-Zustand, in dem die Zelldichte der Maus Hirnrinde als etwa 90000 Zellen / mm 3 14 werden. Um diese Einschränkung zu überwinden und Mitarbeiter Pautot 15 realisiert ein 3D in vitro System, in dem die Zelldichte und die Netzwerkverbindung gesteuert werden, um in vivo-Bedingungen ähnlich und ermöglichen eine Echtzeitabbildung des Netzwerks. In der Praxis wird diese Methode auf dem Konzept, das dissoziiert kultivierten Neuronen können auf Siliciumdioxid-Mikroperlen wachsen basiert. Diese Kügelchen eine Wachstumsoberfläche groß genug für neuronalen Zellkörpern zu haften und ihre Verzweigungen zu wachsen, reifen, zu erweitern und zu definieren synaptische Kontakte zu anderen Neuronen. Diese Methode nutzt die spontane Versammlung Eigenschaften von monodispersen Perlen form 3D-Schichten-hexagonalen Arrays mit verschiedenen Untergruppen von Neuronen auf verschiedenen Ebenen mit eingeschränkter Konnektivität zwischen Nervenzellen auf verschiedenen Perlen. Die erzielte Zelldichte bei diesem Verfahren betrug etwa 75.000 Zellen / mm 3.
Vor kurzem haben wir Pautot Methode angepasst MEAs 16: Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die 3D-elektrophysiologische Aktivität stellt einen größeren Repertoire von Aktivitäten als die von 2D-Netze ausgedrückt. 3D reife Kulturen weisen eine verbesserte Dynamik in der sowohl Netzwerk-Burst und zufällige Spike-Aktivität koexistieren. Ähnlich Tang-Schomer und Mitarbeiter 17 realisiert eine Seidenproteinbasis poröse Gerüst, das eine primäre kortikale Kultur in vitro für einige Monate beibehält, und nahm die elektrophysiologische Aktivität mittels einer Wolfram-Elektrode.
In dieser Arbeit wurden die experimentellen Verfahren, um 3D-neuronalen Netzen, um MEAs gekoppelt bauen beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wird eine neuartige experimentelle in vitro-Plattform aus 3D gemacht entwickelt neuronalen Kulturen auf MEAs für Netzwerk-Elektrophysiologie wurde vorgestellt gekoppelt. Die Verwendung von Mikrokügelchen als Gerüst, um das Auswachsen neuritischen entlang der z-Achse zu ermöglichen wurde maßgeschneidert, um mit der planaren MEA integriert werden. Auf diese Weise können die erhaltenen Mikrosystem ergibt eine gültige und zuverlässige in vitro- 3D-Modells, um die austreten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Giorgio Carlini für die technische Unterstützung bei der Entwicklung der Begrenzungsstruktur und Dott. Ornella LoBrutto für die gründliche Überarbeitung des Manuskripts. Die Forschung, die diese Ergebnisse hat die Finanzierung von 7. Rahmenprogramm der Europäischen Union erhalten (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers Schema) unter Finanzhilfevereinbarung 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
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