Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em> İn Vitro</em> Deneysel Model
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
Mikro-Elektrot Diziler (ÇÇA) bağlanmış in vitro iki boyutlu (2D) sinir ağları nöronal dinamikleri ve temel bağlantı arasındaki etkileşimi incelemek için benimsenen altın standart deneysel bir model arethe. Gelişimi sırasında, nöronlar iyi görüntüler karmaşık ağların yeniden definedspatio-temporalpatternsof aktivite 1,2 (yani patlamaları, ağ patlamaları, rastgele spike aktivitesi). ÇÇA ağ düzeyinde ifade dinamiklerin ayrıntılı bir soruşturma izin birçok sitelerden (onlarca Mikroelektronlar binlerce) elektrofizyolojik etkinliğini kaydedebilirsiniz. Buna ek olarak, ayrışmış kültürlerin kullanılması mühendislik-ağları tasarım possibile yapar. Bu şekilde anlamak kolaydır kaydedilen elektrofizyolojik aktivite arasındaki fonksiyonel ilişkiler ve hücre yoğunluğu 3, modülerlik 4,5 derecesi, heterojen nöronal pop varlığı gibi ağ organizasyonu parametrelerivb ulations 6 Ancak, ayrışmış kültürlenmiş hücreler üzerindeki in vitro çalışmalar, 2D nöronal ağlar dayanmaktadır. Her yönde 7 yayılmış düzleştirilmiş olan 2 boyutlu modeli, somata ve büyüme konilerinin (i) ve akson-dentritler büyümesinin: Bu yaklaşım, in vivo (doğal olarak 3 boyutlu, 3D) sisteme göre basitleştirmeler yol açar. (ii) 2D in vitro ağlar sergi ağının 8 nöronların çoğu içeren aktivitesini patlama hakim elektrofizyolojik dinamikleri kalıplaşmış.
Son zamanlarda, farklı çözüm 3D nöronal ağlar ayrışmış in vitro yapımına izin vermek için geliştirilmiştir. Ortak fikir, nöronlar 3D moda yetişebilen bir iskele oluştururken oluşur. Bu tür bir yapı iskelesi polimer jeller ve katı gözenekli matrisler 9-13 ile gerçekleştirilebilir. Polimerlerin mekanik özelliklerini istismar ederek, bu thes içinde hücrelerin gömmek mümkünneurospheres 11 3D kültürleri üniform bir blok tanımlayarak e yapıları. Bu yaklaşımın temel özelliği neurospheres 9,12 katı mekanik özelliğidir. Ancak, bu malzemelerin gözeneklilik sınırlı ve onlar matrisi içinde hücre göçü garanti etmemektedir. Bu dezavantajı aşmak için, olası bir çözüm 'birim' modülleri matrisi dilimleme ibarettir. Ne yazık ki, parçacıkların büyüklüğü ve şekli çeşitliliği düzenli katmanlı yapılara ambalaj engel olabilir. 7'de, Cullen ve arkadaşları, biyoaktif bir hücre dışı matris bazlı iskele içinde nöronlar ve / veya astrositlerin oluşan bir 3D nöronal yapı olarak tasarlanmıştır. Böyle bir mühendislik nöral doku 3D mikro-ortamlar içinde nörobiyolojik yanıtları incelemek ve işlemek için in vitro araştırmalarda izin verdi. Bu model ekstrasellüler matriks (ECM) ve / veya hidrojel iskeleleri (500-600 mikron kalınlığında) boyunca dağıtılan nöron ve glia oluşuyordu. Bu co/ mm3 5000 hücreleri – ndition, optimum hücre canlılığı (% 90'dan fazla) 3.750 nihai yoğunlukta hücreler kaplanarak bulunmuştur. Böyle bir yoğunluk değeri fare beyin korteks hücre yoğunluğu yaklaşık 90,000 hücre / mm3 14, in vivo bir durumda bir, çok daha düşük olduğunu belirtmek gerekir. Bu sınırlama Pautot üstesinden gelmek ve 15 hücre yoğunluğu ve ağ bağlantı ağının gerçek zamanlı görüntüleme sağlarken in vivo koşullarında benzer şekilde kontrol edilmektedir 3B, in vitro bir sistem hayata coworkers için. Pratikte, bu yöntem kültürlü nöronlar silis mikro büyümeye edebiliyoruz ayrışmış kavramına dayanmaktadır. Bu boncuklar uyması nöronal hücre gövdeleri ve olgun büyümek uzatmak ve diğer nöronlara sinaptik kişileri tanımlamak için kendi arborizations için yeterince büyük bir büyüme yüzey sağlar. Bu yöntem, fo mono-disperse boncuk kendiliğinden düzeneği özelliklerini kullananrm 3D farklı boncuklar üzerinde nöronlar arasındaki kısıtlı bağlantısı ile farklı katmanlarda nöronların farklı alt kümelerini içeren altıgen diziler katmanlı. Bu yöntemle elde edilen hücre yoğunluğu / mm3 yaklaşık 75,000 hücre idi.
Son zamanlarda, biz ÇÇA'lar 16 Pautot yöntemi adapte olması: Elde edilen sonuçlar 3D elektrofizyolojik aktivite 2D ağlar tarafından ifade olandan faaliyetlerinin geniş bir repertuara sunan olduğunu göstermektedir. 3D olgun kültürler gelişmiş bir dinamik sergiler hangi ağ patlaması ve rastgele başak aktivite bir arada hem. Benzer şekilde, Tang ve arkadaşları, 17 Schomer birkaç ay in vitro primer kortikal kültür muhafaza eden bir ipek proteini bazlı gozeneklı iskeleyi fark ve tungsten elektrot ile elektrofizyolojik aktivite göstermiştir.
Bu çalışmada, deneysel prosedürleri ÇÇA bağlanmış 3D nöron ağları kurmak için tarif edilecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, 3D oluşan in vitro platformda yeni bir deneysel ağ elektrofizyoloji için ÇÇA sunulmuştur bağlanmış nöronal kültürleri mühendislik. Z -Axis boyunca nöritik büyümesine izin iskele olarak mikro kullanımı düzlemsel MEA ile entegre edilmek üzere özel olmuştur. Bu şekilde, geçerli ve güvenilir bir in vitro 3D model elde mikro sistem sonuçları ortaya çıkan elektrofizyolojik dinamiklerini 16 incelemek için.
MEA kay?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar lohusalık yapısı ve dott gelişmekte teknik destek Giorgio Carlini teşekkür ederiz. Yazının kapsamlı revizyon için Ornella LoBrutto. Bu sonuçlara önde gelen araştırma Avrupa Birliği'nin 7. Çerçeve Programı'ndan fon aldı (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Genç Kaşifler düzeni) hibe anlaşması 284.772 BEYİN BOW altında (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cell. , (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- Frega, M., et al. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. , 957-960 (2013).
