粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング
Summary
Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.
Abstract
Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.
Introduction
ほとんどの細菌細胞は、両方のプランクトン（自由生活）と成長1の表面に付着した（固着）モードを採用することができます。成長の表面接続モードでは、細菌細胞が分泌し、バイオフィルムを形成するために、細胞外高分子物質（EPS）を大量に身を包みます。 EPSは、主にタンパク質、エキソポリサッカライド、外DNAで構成され、バイオフィルム形成2に不可欠です。これは、細菌が空間的に区別するために使用することが可能な物理的な足場として機能し、有害な環境条件と宿主応答から細菌を保護します。 EPSのさまざまなコンポーネントは、バイオフィルム形成3で異なる役割を持っており、EPSの成分の発現の変化は劇的にバイオフィルム構造体4 を改造することができます。 EPS成分も分子5のシグナルとして機能することができ、最近の研究では、それらの移動およびバイオフィルム差分を案内するために微生物細胞と相互作用する特定のEPSのコンポーネントを示していますerentiation 6-8。
EPSの研究は大きく、EPS 9,10の特定のコンポーネントで欠損変異によって生成したバイオフィルムの形態学的な分析に基づいて進んでいます。また、EPSは通常、マクロスケール（バルク特性評価）11で特徴づけられます。形態学的には、しかし、定量的なディテールやバルク特性評価を欠いて、平均値を返し、バイオフィルムの異質内に存在する詳細を失うことができます分析します。マイクロスケールでのEPSのメカニック特性のリアルタイム特性評価に進行する増加傾向が存在することになります。このプロトコルは、粒子追跡マイクロレオロジーは、 緑膿菌バイオフィルム4の粘弾性および有効な架橋のマトリックス成 分ペルとPSLエキソポリサッカライドの時空間的効果を決定することができる方法を示しています。
パッシブマイクロレオロジーは、簡単かつ安価であるRH日付12,13の材料の空間microrheologicalサンプリングの最高のスループットを提供eology方法。受動的なマイクロレオロジーでは、プローブ球体は、サンプル中に配置され、熱エネルギー（k BはT）によって駆動されるそれらのブラウン運動は、ビデオ顕微鏡が続きます。いくつかの粒子が同時に追跡することができ、粒子の時間依存座標は、従来のランダムウォークに従ってください。したがって、平均して、粒子は、同じ位置にとどまります。しかし、粒子の変位の標準偏差または平均二乗変位（MSD）は、ゼロではありません。粘性流体が流れているので、時間が進むにつれて、粘性流体中の粒子のMSDは、直線的に増加します。これとは対照的に、粘弾性又は弾性物質で見られる高分子架橋は、彼らが流れに抵抗するのに役立ち、かつ粒子がMSD曲線（ 図1A）でプラトーにつながる、その変位の限らになります。この観察は、関係を次のMSDαt <sαは、物質の弾性と粘性の寄与の割合を関連している拡散指数であるα、>アップ。 MSDはまた、恒久的に上に変形する材料の傾向である、クリープコンプライアンスを計算するために使用することができる粘性流体にα= 1、粘弾性物質で0 <α<1、及び弾性物質でα= 0で移動する粒子について時間とは、どのように簡単に材料のスプレッドを推定します。
粒子の大きさ、密度、および表面化学はmicrorheological実験の正確な適用に重要である（この場合、バイオフィルムマトリックスのポリマーは、 図1Bを参照）について検討システムに関して選択されます。まず、粒子は、粒子自体よりもはるかに小さい構造を持つ物質のレオロジーを測定します。物質の構造は、粒子、額面の動きと同様の規模のものである場合ticleは、個々の構造の形状や向きによって乱されます。しかし、粒子の周囲の構造が非常に小さい場合、この効果は小さく、粒子（ 図1B）に均質な環境を提示し、平均化。第二に、粒子の密度は、媒体（1.05グラムml -1の水性媒体のための）沈降を回避し、慣性力が無視できるようにしていることのようになります。ポリスチレンラテックス粒子のほとんどは、上記の基準を満たしています。運動は、物質の構造と熱エネルギーとの衝突によって駆動される、ランダムであれば、粒子のMSDのレオロジー解釈にのみ有効ですとして理想的には、粒子がバイオフィルムマトリックスのポリマーと相互作用しません。これは、プローブ粒子は、プレバイオフィルムの成長表面に結合するか、バウンスする傾向があるかどうかをチェックすることによって観察することができます。しかし、バイオフィルムへの魅力の欠如にもかかわらず、粒子がマトリックスに組み込むことができる必要があります。また、バイオフィルムの物理化学的不均一性は、異なる粒子は、バイオフィルムの異なる領域におけるプローブとして、より適している可能性があります。したがって、異なるサイズおよび表面化学の粒子は、バイオフィルムに適用されるべきです。
このように、粒子のMSDは、異なる成分がレオロジーに寄与し、バイオフィルムの拡散方法に関する有用な情報を提供することができます。さらに、異なるプローブの使用は1つがバイオフィルムの空間の物理化学的不均一性に関する情報を導出することができます。この方法は、バイオフィルムの機械的特性に影響抗菌治療を試験するために使用される、またはバイオフィルムの機械的特性は、別の種の導入によって変更されたかを調査するために、混合種バイオフィルムに適用することができます。粒子のMSDはまた、バイオフィルムの分散を特徴付けるために有用であり得ます。このような研究は、潜在的にAバイオフィルムの治療を改善する、バイオフィルムの我々の理解に役立つであろうND便利な活動のためのバイオフィルムのエンジニアリング。
Protocol
Representative Results
Discussion
マイクロレオロジーは、微生物バイオフィルムなどの異種システム、で地元のレオロジー測定のための便利なツールです。これは、複数の時点にわたって同じ生物学的サンプル中のレオロジーの変化のリアルタイム監視を可能にする、非破壊的技術です。このプロトコルでは、粒子追跡マイクロレオロジーは、それらが弾力性とバイオフィルムマトリックスの効果的な架橋をどのように影響?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は優秀プログラムのその研究センターの下で教育シンガポール国立研究財団と省によってサポートされ、スタートアップ助成ナンヤン工科大学から（M4330002.C70）、およびACRFティア2（MOE2014-T2-2-172）教育省、シンガポールから。著者は、このプロトコルのデモに参加するためジョーイヤムクオックHoongに感謝します。
Materials
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 mL | Terumo | ||
| 27G Needle | Terumo | ||
| 2L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup | ||
References
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