In Situ Kartlegging av de mekaniske egenskapene til Biofilm av Partikkel-sporing Microrheology

Summary

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Abstract

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Introduction

De fleste bakterieceller er i stand til å ansette både planktoniske (frittlevende) og overflate festet (fastsittende) måter vekst ^1. I det overflate festet modus for vekst, bakterieceller utskiller og omslutter seg selv i store mengder av ekstracellulære polymere stoffer (EPS) for å danne biofilmer. EPS består hovedsakelig av proteiner, exopolysaccharide, ekstracellulære DNA og er vesentlig for biofilmdannelse ^to. Det fungerer som en fysisk stillas der bakterier kan bruke til å differensiere romlig og beskytter bakteriene mot skadelige miljøforhold og vertsresponser. Ulike komponenter av EPS har forskjellige roller i biofilmdannelse ^{3 og} endringer i uttrykket av EPS komponenter kan dramatisk remodel biofilm strukturer ^4. EPS komponenter kan også fungere som signalmolekyler ^5, og nyere studier har vist visse EPS komponenter i samspill med mikrobielle celler til å veilede sine migrasjon og biofilm diffdifferensieringen ^6-8.

Forskning på EPS har sterkt avansert basert på morfologiske analyser av biofilm produsert av mutanter defekte i en spesifikk komponent i EPS ^9,10. I tillegg er EPS vanligvis karakterisert på makro-skala (bulk karakteristikk) ^11. Morfologisk analyse kan imidlertid mangle kvantitativ detaljer og bulk karakterisering, som returnerer gjennomsnittsverdier, mister den detalj som eksisterer innenfor heterogenitet av biofilm. Det er nå en økende trend å gå videre til sanntid karakterisering av de mekaniske egenskapene EPS på mikro-skala. Denne protokollen demonstrerer hvordan partikkel-sporing microrheology er i stand til å bestemme tid og rom virkningene av matrikskomponenter Pel og PSL exopolysaccharides på viskoelastisiteten og effektiv kryssbinding av Pseudomonas aeruginosa biofilm ^4.

Passiv microrheology er en enkel og rimelig rheology metode som gir den høyeste gjennomstrømningen av romlig microrheological sampling av et materiale hittil ^12,13. I passive microrheology, blir sonde kuler plasseres i prøven og deres Brownske bevegelser, som drives av termiske energier (k _B t) er etterfulgt av videomikroskopi. Flere partikler kan spores samtidig, og den tidsavhengige koordinatene til partiklene følge en konvensjonell tilfeldig gange. Derfor er, i gjennomsnitt, partiklene forblir i samme stilling. Imidlertid standardavviket forskyvningene eller den midlere kvadrerte forskyvning (MSD) av partiklene, ikke er null. Siden viskøse væsker strømmer, partikkel MSD i et viskøst fluid vokser lineært som tiden går. I motsetning til den polymere tverrbinding som finnes i viskoelastiske eller elastiske stoffer hjelpe dem til å motstå strømningen, og partiklene blir begrenset i sin forskyvning, som fører til platåer i MSD kurven (figur 1A). Denne observasjonen følger forholdet MSDαt <sopp> α, hvor α er den diffusive eksponent som er relatert forholdet mellom elastiske og viskøse bidrag til forbindelsen. For partikler som beveger seg i viskøse væsker a = 1, i viskoelastiske substanser 0 <α <1, og i elastiske stoffer α = 0. MSD kan også brukes til å beregne krype compliance, som er tendensen for materialet til å deformeres permanent i løpet tid og anslår hvor lett et materiale oppslag.

Størrelse, tetthet og overflatekjemi av partikkelen er kritiske for riktig anvendelse av microrheological eksperiment, og er valgt med hensyn til systemet undersøkt (i dette tilfelle av polymerene i biofilmen matrisen, se figur 1B). For det første måler partikkel reologien av stoffet med strukturer som er meget mindre enn selve partikkelen. Dersom stoffet strukturer er av tilsvarende skala til partikkelen, bevegelse av particle blir perturbert av formen og orienteringen av de individuelle strukturene. Men hvis strukturer som omgir partikkelen er mye mindre, er denne effekten liten og gjennomsnitt ut, presentere et homogent miljø til partikkelen (figur 1B). For det andre, bør tettheten av partikkelen være lik mediet (1,05 g ml ^{-1 for} vannbaserte medier), slik at sedimentering unngås og treghetskrefter er ubetydelige. De fleste partikler med isopor innhegninger oppfyller kriteriene ovenfor. Ideelt sett betyr partikkel ikke reagerer med polymerene i biofilmen matrise som reologiske tolkningen av partikkel MSD er bare gyldig hvis bevegelse er tilfeldig, drevet av termisk energi og kollisjon med stoffstrukturer. Dette kan observeres ved å sjekke hvorvidt sonden partikkelen har en tendens til å binde eller sprette av overflaten av en pre-voksen biofilm. Men til tross for mangelen på tiltrekning til biofilmen, må partiklene være i stand til å bli inkorporert i matrisen.I tillegg kan de fysio heterogenitet av biofilm resultere i forskjellige partikler som er mer egnet som prober i forskjellige deler av biofilmen. Derfor bør partikler av forskjellige størrelser og overflatekjemi bli brukt til biofilmen.

Som sådan, er partikkel MSD i stand til å gi nyttig informasjon om hvordan forskjellige komponenter bidrar til reologien og spredning av biofilmen. Videre, bruk av forskjellige sonder gjør det mulig å utlede informasjon om den romlige fysio heterogenitet av biofilm. Denne fremgangsmåten kan brukes for å teste effekten antimikrobiell behandling på de mekaniske egenskaper av biofilm, eller anvendes for blandede arter biofilmer å undersøke hvordan de mekaniske egenskaper for biofilm blir endret fra innføringen av en annen art. Partikkel muskel- og skjelettlidelser kan også være nyttig for å karakter biofilm spredning. Slike studier vil være nyttig i vår forståelse av biofilm, potensielt forbedre biofilm behandlingernd prosjektering av biofilm for nyttige aktiviteter.

Protocol

1. Biofilm Dyrking Utarbeidelse av bakteriestammer 1 dag før biofilm dyrking, forberede planktoniske bakteriekulturer ved inokulering 2 ml passende vekstmedium fra fryst bakteriekultur. Bruk Luria Broth-medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 gjærekstrakt, og 10 g l -1 trypton) for mucoid P. aeruginosa og dets Δ Pel og Δ PSL defekte mutanter. Inkuber over natten ved 37 ° C og 200 opm ryster betingelser. Fortynne natten kulturer til en OD <sub…

Representative Results

De lokale viskoelastiske egenskaper for biofilm i forskjellige regioner av biofilm, som omfattet hulrommene (mellom over biofilmen), flater (udifferensiert flate lag av celler) og mikrokolonier (se etiketter i figur 2A) ble undersøkt. Den tidsmessige endringer i viskoelastiske egenskaper av biofilm under modning fra dager 3 til 5 ble også bestemt. MSD av partiklene i hulrommene ble anvendt som en kontroll, og kan sammenlignes med MSD av partikler i rent medium. I motsetning til dette, partikler fanget…

Discussion

Microrheology er et nyttig verktøy for lokale reologiske målinger i heterogene systemer, for eksempel mikrobiell biofilm. Det er en ikke-destruktiv teknikk, slik at sanntidsovervåking av reologiske endringer innen samme biologiske prøven over flere tidspunkter. I denne protokollen, ble partikkel-sporing microrheology påført Pel og PSL exopolysaccharide mutanter for å undersøke hvordan de påvirker elastisitet og effektiv kryssbinding av biofilm matrise. PSL favoriserer utvikling av elastiske biofilmer med høy e…

Materials

Fluorspheres	Invitrogen	F-8821	1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss		Epifluorescent Microscope
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Peristaltic pump
Flow Cell Chambers	Technical University of Denmark
Bubble Trap	Technical University of Denmark
Silicone Tubing	Dow Corning		3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter
Clear polypropylene plastic connectors	Cole Parmer	06365-83	1/16 in. (1.588 mm)
Binder Clips			To clamp tubing
Coverslips	Thermo Scientific™ Nunc™		50 x 24 mm
Syringe 3 mL	Terumo
27G Needle	Terumo
2L Storage/Media Bottles	VWR®
Trolley			To hold biofilm setup