In situ Kartläggning av de mekaniska egenskaperna hos Biofilmer av Partikel-tracking Microrheology

Summary

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Abstract

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Introduction

De flesta bakterieceller har möjlighet att anställa både plankton (fritt levande) och utanpå bifogas (fastsittande) sätt tillväxt ^1. I ytan lösa läge för tillväxt, bakterieceller utsöndrar och innesluta sig i stora mängder extracellulära polymera substanser (EPS) för att bilda biofilmer. EPS består huvudsakligen av proteiner, exopolysackarid, extracellulär DNA och är väsentligt för biofilmbildning ^2. Den fungerar som en fysisk klätterställning genom vilken bakterier kan använda för att skilja spatialt och skyddar bakterierna från skadliga miljöförhållanden och värdsvar. Olika komponenter av EPS har distinkta roller i biofilmbildning ³ och förändringar i expression av EPS-komponenter kan dramatiskt omforma biofilm ^strukturerna 4. EPS komponenter kan också fungera som signalmolekyler ⁵ och senare studier har visat vissa EPS komponenter som interagerar med mikrobiella celler för att vägleda sina migration och biofilm differentiation ^6-8.

Forskning om EPS har i hög grad avancerade baserad på morfologiska analyser av biofilmer producerats av mutanter defekta i en viss del av EPS ^9,10. Dessutom är EPS kännetecknas vanligen på makroskala (bulk karakterisering) ^11. Morfologiska analyser kan dock sakna kvantitativa detalj och bulk karakterisering, som returnerar medelvärden, förlorar detalj som finns inom heterogenitet biofilmen. Det finns nu en ökande trend att gå vidare till realtid karakterisering av de mekaniska egenskaperna av EPS på mikroskala. Detta protokoll visar hur partikelspårning microrheology kan bestämma Spatiotemporal effekterna av matrixkomponenter Pel och PSL exopolysackarider på viskoelasticitet och effektiv tvärbindning av Pseudomonas aeruginosa biofilmer ^4.

Passiv microrheology är en enkel och billig rheology metod som ger den högsta genomströmningen av rumslig microrheological provtagning av ett material som hittills ^12,13. I passiva microrheology är sond sfärer placeras i provet och deras Brownsk rörelse, driven av termiska energier (k _B T) följs av video mikroskopi. Flera partiklar kan spåras simultant, och de tidsberoende koordinater partiklarna följer en konventionell slumpmässig promenad. Därför, i genomsnitt, de partiklar blir kvar i samma position. Emellertid standardavvikelsen för förskjutningarna eller medelkvadrat förskjutningen (MSD) för partiklarna, inte är noll. Eftersom viskösa vätskor flöda, partikeln MSD i en trögflytande vätska växer linjärt eftersom tiden går. Däremot polymertvärbindning som finns i viskoelastisk eller elastiska substanser hjälper dem att motstå flöde och partiklar blir begränsade i deras förskjutning, vilket leder till platåer i MSD-kurvan (Figur 1A). Denna observation följer relationen MSDαt <supp> α, där α är det diffuse exponent som är relaterad förhållandet mellan elastiska och viskösa bidrag av ämnet. För partiklar som rör sig i viskösa vätskor a = 1, i viskoelastiska ämnen 0 <α <1, och i elastiska ämnen α = 0. MSD kan också användas för att beräkna krypplan, där det är tendensen hos materialet att deformeras permanent över tid och uppskattar hur lätt ett material uppslag.

Storleken, densitet och ytkemin hos partikeln är kritiska för den korrekta tillämpningen av microrheological experimentet och är valda med avseende på det system studerats (i detta fall polymerema i biofilmen matrisen, se figur 1B). För det första mäter partikeln reologin av ämnet med strukturer som är mycket mindre än själva partikeln. Om ämnets strukturer är av liknande omfattning till partikeln, rörelse partikel störs av formen och orienteringen av de individuella strukturerna. Men om de strukturer som omger partikeln är mycket mindre, är denna effekt liten och utjämnas, presentera en homogen miljö till partikeln (Figur 1B). För det andra bör densiteten för partikeln vara liknande till mediet (1,05 g ml ^-1 för vattenbaserade medier), så att sedimentering undviks och tröghetskrafter är försumbara. De flesta partiklar med polystyren gitter uppfyller ovanstående kriterier. Helst omfattar partikeln inte interagerar med polymererna biofilmen matris enligt den reologiska tolkningen av partikel MSD gäller endast om rörelse är slumpmässig, drivet av värmeenergi och kollision med ämnesstrukturerna. Detta kan observeras genom att kontrollera huruvida sonden partikel tenderar att binda eller studsa ytan av en pre-vuxen biofilm. Men trots avsaknaden av attraktion till biofilmen måste partiklarna kunna inkorporeras i matrisen.Dessutom kan den fysiokemiska heterogenitet biofilmen resultera i olika partiklar är mer lämpade som sönder i olika regioner i biofilmen. Sålunda bör partiklar av olika storlek och ytkemi appliceras på biofilmen.

Som sådan, är partikel MSD kan ge användbar information om hur olika komponenter bidrar till reologi och spridning av biofilm. Vidare har användningen av olika sönder tillåter en att härleda information om den rumsliga fysiokemiska heterogenitet av biofilmen. Denna metod kan användas för att testa effekten antimikrobiell behandling på de mekaniska egenskaperna hos biofilmen, eller för bland biofilmer arter att undersöka hur de mekaniska egenskaperna hos biofilmen ändras från införandet av en annan art. Partikel muskuloskeletala sjukdomar kan även vara användbara för karakterisering av biofilm spridning. Sådana studier skulle vara till hjälp i vår förståelse av biofilmer, potentiellt förbättra biofilm behandlingar pernd engineering av biofilmer för nyttiga aktiviteter.

Protocol

1. Biofilm Odling Framställning av Bakteriestammar 1 dag före biofilm odling, förbereda planktonbakteriekulturer genom ympning 2 ml lämpligt odlingsmedium från frysta bakteriekultur. Använd Luria-Broth-medium (10 g L -1 NaCI, 10 g L -1 jästextrakt och 10 g L -1 trypton) för mukoid P. aeruginosa och dess Δ PEL och Δ PSL defekta mutanter. Inkubera över natten vid 37 ° C och 200 rpm skakning betingelser. Späd övernattskulturer til…

Representative Results

De lokala viskoelastiska egenskaperna hos biofilmen i olika regioner av biofilmen, som omfattade hålrummen (medel ovanför biofilmen), slätter (odifferentierad plant skikt av celler) och mikrokolonier (se etiketterna i Figur 2A) undersöktes. De tidsmässiga förändringar i viskoelastiska egenskaper biofilmen under mognaden från dagar 3 till fem bestämdes också. MSD av partiklarna i hålrummen användes som en kontroll och jämförbar med MSD av partiklar i ren mediet. I motsats, …

Discussion

Microrheology är ett användbart verktyg för lokala reologiska mätningar i heterogena system, såsom mikrobiella biofilmer. Det är en icke-förstörande teknik, gör det möjligt för realtidsövervakning av reologiska förändringar inom samma biologiska provet över flera tidpunkter. I detta protokoll var partikel-tracking microrheology tillämpas på Pel och PSL mutanter exopolysackarid för att undersöka hur de påverkar elasticiteten och effektiv tvärbindning av biofilmen matrisen. PSL gynnar utvecklingen av …

Materials

Fluorspheres	Invitrogen	F-8821	1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss		Epifluorescent Microscope
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Peristaltic pump
Flow Cell Chambers	Technical University of Denmark
Bubble Trap	Technical University of Denmark
Silicone Tubing	Dow Corning		3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter
Clear polypropylene plastic connectors	Cole Parmer	06365-83	1/16 in. (1.588 mm)
Binder Clips			To clamp tubing
Coverslips	Thermo Scientific™ Nunc™		50 x 24 mm
Syringe 3 mL	Terumo
27G Needle	Terumo
2L Storage/Media Bottles	VWR®
Trolley			To hold biofilm setup