تحليل<em> يرسينيا القولون</em> المستجيب إزفاء في الخلايا المضيفة عن طريق بيتا لاكتاماز المستجيب الإنشطار
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
العديد من أنواع البكتيريا سالبة الجرام المسببة للأمراض بما في ذلك اليرسنية. توظف النوع الثالث أنظمة إفراز لنقل من البروتينات المستجيب إلى الخلايا المستهدفة حقيقية النواة. داخل الخلية المضيفة البروتينات المستجيب التلاعب الوظائف الخلوية لصالح البكتيريا. لفهم أفضل للسيطرة على نوع إفراز III خلال تفاعل الخلية المضيفة وحساسة وفحوصات دقيقة لقياس النبات مطلوبة. نحن هنا وصف تطبيق مقايسة على أساس الاندماج من يرسينيا القولون البروتين المستجيب جزء (يرسينيا البروتين الخارجي؛ YopE). مع TEM-1 بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي من النبات ويعتمد الفحص على الانقسام خلية نفيذ الحنق صبغ (CCF4 / AM) بواسطة translocated الانصهار بيتا لاكتاماز. بعد الانقسام من السيفالوسبورين جوهر CCF4 من قبل بيتا لاكتاماز، الحنق من الكومارين إلى تعطل فلوريسئين والإثارة من شاردة الكومارين يؤدي إلى انبعاث مضان الأزرق.وقد وصفت التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة في الأدب تسليط الضوء على تنوعها. يسمح طريقة لتحليل النبات في المختبر، وأيضا في في الجسم الحي، على سبيل المثال، في نموذج الفأر. الكشف عن إشارات مضان يمكن القيام بها باستخدام لوحة القراء، تحليل FACS أو مضان المجهر. في الإعداد الموصوفة هنا، في النبات المختبر من اندماج المستجيب إلى خلايا هيلا من قبل المسوخ اليرسنية مختلفة يتم مراقبتها عن طريق المسح الضوئي ليزر المجهري. تسجيل تحويل الخلايا لمراسل الحنق من قبل المستجيب الانصهار بيتا لاكتاماز في الوقت الحقيقي يوفر النتائج الكمية قوية. نحن هنا تظهر البيانات النموذجية، مما يدل على زيادة النبات من قبل Y. متحولة القولون YopE مقارنة نوع السلالة البرية.
Introduction
النوع الثالث أنظمة إفراز بروتين هي آلات التصدير المتخصصة التي تستخدمها أجناس مختلفة من البكتيريا سالبة الجرام لتسليم مباشرة البروتينات المستجيب المشفرة البكتريا إلى الخلايا المستهدفة حقيقية النواة. بينما آلية إفراز نفسها الحفظ جدا، وقد تطورت مجموعات متخصصة من البروتينات المستجيب بين الأنواع البكتيرية المختلفة لمعالجة مسارات الإشارات الخلوية وتسهيل استراتيجيات الفوعة البكتيرية محددة 1. في حالة اليرسنية، تصل إلى سبعة البروتينات المستجيب، ما يسمى Yops (يرسينيا البروتينات الخارجي)، وtranslocated على اتصال الخلية المضيفة والعمل معا لتخريب استجابات الخلايا المناعية مثل البلعمة وخلوى الإنتاج، أي، للسماح بقاء خارج الخلية من البكتيريا 2-4. يتم التحكم في عملية النبات بإحكام في مراحل مختلفة 5. ثبت أن تفعيل الرئيسي للT3SS يتم تشغيل عن طريق الاتصال به لم المستهدفةليرة لبنانية 6. ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة لهذه المبادرة هي حتى الآن إلى توضيح. في اليرسنية يتم التوصل إلى المستوى الثاني من ما يسمى صقل النبات عن طريق حتى- أو نشاط البروتينات الخلوية رو GTP ملزم RAC1 أو RhoA التنظيم إلى أسفل. تفعيل RAC1 مثلا الإنفازين أو السامة للخلايا عامل الناخر Y (كنف-Y) يؤدي إلى زيادة النبات 7-9، في حين أن GAP (GTPase تفعيل بروتين) وظيفة من translocated YopE ينظم أسفل النشاط RAC1 وبالتالي يقلل النبات من نوع ردود الفعل السلبية آلية 10،11.
طرق صحيحة ودقيقة هي شرط أساسي لمعرفة كيف يتم تنظيم النبات خلال اليرسنية تفاعل الخلية المضيفة. وقد استخدمت العديد من أنظمة مختلفة لهذا الغرض، ولكل منها مزايا وعيوب محددة. بعض المناهج تعتمد على تحلل الخلايا المصابة ولكن ليس البكتيريا عن طريق المنظفات المختلفة التي تتبعها تحليل لطخة غربية. عشرالبريد العيب المشترك بين هذه الأساليب هو أن تحلل بكتيرية طفيفة ولكن لا مفر منه يحتمل أن يلوث المحللة الخلية مع البكتيريا المرتبطة البروتينات المستجيب. ومع ذلك، تم اقتراح علاج الخلايا مع بروتين K أن تتحلل البروتينات المستجيب خارج الخلية واستخدامها لاحقا من ديجيتونين للتحلل الانتقائي للخلايا حقيقية النواة للحد من هذه المشكلة 12. الأهم من ذلك، هذه المقايسات تعتمد بشكل حاسم على جودة عالية أضداد المستجيب، التي هي في معظمها غير متوفرة تجاريا. محاولات لاستخدام اندماج متعدية من البروتينات المستجيب والبروتينات الفلورية مثل GFP لرصد النبات لم تكن ناجحة ربما يرجع ذلك إلى هيكل كروي العالي من البروتينات الفلورية وعدم قدرة الجهاز إفراز تتكشف لهم قبل إفراز 13. ومع ذلك، العديد من علامات مراسل مختلفة مثل CYA (التي تعتمد على كالمودولين محلقة الأدينيلات) المجال من السعال الديكي البورديتيلة السم cyclolysin 14 أو فلاشاستخدمت العلامة بنجاح لتحليل النبات. في مقايسة السابق يتم استخدام النشاط الأنزيمي من CYA لتضخيم إشارة من البروتين الانصهار داخل الخلايا، في حين أن العلامة فلاش، لtetracysteine قصيرة جدا (4Cys) العلامة عزر، يسمح لوضع العلامات مع فلاش صبغ biarsenical دون إزعاج عملية إفراز 15.
وذكرت النهج المطبق هنا لأول مرة من قبل شاربنتييه وآخرون. ويستند على تحويل الخلايا من فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) صبغ CCF4 التي كتبها translocated المستجيب TEM-1 بيتا لاكتاماز اندماج 16 (الشكل 1A). CCF4 / AM هو مركب خلايا نفيذ التي ترتبط في المتفرعة الكومارين (المانحة) وشاردة فلوريسئين (متقبل) من خلال نواة السيفالوسبورين. عند الدخول السلبي في الخلية حقيقية النواة، ومعالجة عدم الفلورسنت أسترته CCF4 / AM بواسطة مركب esterases الخلوية إلى CCF4 اتهم والفلورسنت، وبالتالي المحاصرينداخل الخلية. الإثارة شاردة الكومارين في 405 نانومتر النتائج في الحنق إلى شاردة فلوريسئين، التي تنبعث إشارة مضان أخضر في 530 نانومتر. بعد الانقسام من السيفالوسبورين الأساسية من الحنق بيتا لاكتاماز تعطل والإثارة من شاردة الكومارين يؤدي إلى انبعاث مضان الأزرق at460 نانومتر. وقد وصفت التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة في الأدب تسليط الضوء على تنوعها. يسمح طريقة لتحليل النبات في المختبر، وأيضا في في الجسم الحي، على سبيل المثال، تم استخدام هذه التقنية في نموذج عدوى الماوس لتحديد السكان الكريات البيض التي تستهدف النبات في الجسم الحي 17-19. ويمكن إجراء قراءات الإشارات باستخدام قارئ لوحة، وتحليل FACS أو مضان المجهر. من المذكرة، وطريقة يوفر أيضا إمكانية لمراقبة النبات في الوقت الحقيقي من خلال المجهر الخلية الحية أثناء 20،21 عملية العدوى. هنا تم تطبيق المسح بالليزر مضان المجهر لreadouطن من إشارات مضان كما يوفر أعلى حساسية ودقة. على وجه الخصوص، والقدرة على ضبط نافذة الانبعاثات بدقة نانومتر في تركيبة مع كشف حساسة عالية يسهل الأمثل كشف مضان وتقليل عبر الحديث. وبالإضافة إلى ذلك يمكن تكييف هذا الإعداد المجهر لرصد الوقت الحقيقي من النبات ويحتمل أن يسمح للتحليل المتزامن للتفاعل المضيف الممرض على المستوى الخلوي.
في هذه الدراسة معدلات النبات من Y. وقد تم تحليل القولون نوع السلالة البرية والحذف متحولة YopE اظهار النمط الظاهري hypertranslocator 10،11 exemplarily.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا طبقت بنجاح مقايسة على أساس TEM-1 مراسل بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي من المستجيب النبات عن طريق Y. القولون. وقد وصفت العديد من الأشكال المختلفة لهذه التقنية حساسة ومحددة واضحة نسبيا في الأدب. في هذه الدراسة تم إجراء المسح الضوئي ليزر المجهري للكشف الأكثر حساس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
