분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

요약

III형 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 이펙터 전좌는 그람 음성 박테리아 사이에서 일반적인 독성 전략입니다. 전좌의 정량 분석을 위한 beta-lactamase effector fusion 기반 분석법을 적용했습니다. Yersinia에 감염된 세포에서 베타-락타마제에 의한 FRET 리포터의 전환은 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

초록

병원성 르시 니아 종을 포함한 많은 그람 음성균이. 진핵 표적 세포에 효과기 단백질을 이동시키다하기에게 유형 III 분비 시스템을 사용한다. 숙주 세포 내부에 효과기 단백질은 박테리아의 수혜 세포 기능을 조작. 더 나은 전위를 측정하는 숙주 세포의 상호 작용, 민감하고 정확한 분석하는 동안 유형 III 분비의 조절을 이해하기 위해 필요합니다. 우리는 여기 르시 니아 enterocolitica 효과기 단백질 단편의 융합에 기초한 어 세이 (예 르시 니아 외 단백질; YopE)의 응용 기술한다. 전좌의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 - 락타 마제와이 분석은 세포의 분열에 의존 투과 FRET 염료 전좌 베타 - 락타 마제 융합에 의해 (CCF4 / AM). 형광이 중단 및 쿠마린 부분의 여기 파란색 형광 방출로 연결되어있는 베타 - 락타 마제에 의해 CCF4의 세 팔로 스포린 코어의 절단 후, 쿠마린에서 FRET.이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 방법은 마우스 모델에서 생체 외 분석을위한 전위도 생체 예에서 허용한다. 형광 신호의 검출은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 다른 예 르시 니아 돌연변이가 HeLa 세포에 이펙터 융합체의 생체 전위에서, 여기에 설명 된 설정에서 레이저 스캐닝 현미경에 의해 모니터링된다. 실시간으로 베타 - 락타 마제 이펙터 융합하여 FRET 기자의 세포 내 변환을 기록하는 강력한 정량적 인 결과를 제공합니다. 우리는 여기서 Y로 증가 전위를 보여주는 대표적인 데이터를 표시 야생형 균주에 비해 enterocolitica YopE 변이체.

서론

타입 III 분비 시스템은 직접 진핵 표적 세포 내로 세균 부호화 이펙터 단백질을 제공하는 그람 음성 박테리아에 의해 이용되는 다른 장군 특수한 단백질 수출 기계이다. 분비 기계 자체가 고도로 보존되는 동안 효과기 단백질의 특별한 세트는 셀룰러 신호 경로를 조작하고 특정 박테리아 병원성 ^{1 전략을} 용이하게하기 위해 다양한 세균 종에 진화 해왔다. 르시 니아 경우, 일곱 이펙터 단백질, 소위 Yops (르시 니아 외 단백질)까지, 숙주 세포 접촉에 전좌 및 즉 식세포 및 사이토 카인 생산과 같은 면역 세포 반응을 파괴하기 위해 함께 작동되어, 세균의 세포 생존을 허용 ^2-4. 전위의 프로세스 밀접 다른 단계 ^5에서 제어된다. 그것은 T3SS의 기본 활성화가 목표 CE에의 접촉에 의해 유발되는 것을 설립LL ^6. 그러나,이 개시의 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지된다. 예 르시 니아에서 전위의 소위 미세 조정의 두 번째 수준은 상향 또는 하향 조절 세포의 Rho GTP 결합 단백질 RAC1 또는에서 RhoA의 활성을 얻을 수있다. invasin 또는 세포 독성 괴사 인자 Y (CNF-Y)에 의해 예를 들면 RAC1의 활성화....

프로토콜

1. 피크 방출 및 크로스 토크 결정 (또한 그림 2 참조)

1. , 발광 피크와 도너 사이의 크로스 토크 (쿠마린 유도체의 V450) 및 억 셉터 (형광) 염료의 양을 결정 405㎚, 여기에서 개별 형광 표지 된 세포 모두의 스펙트럼 스캔을 수행하기 위해.
2. 기증자 및 수용체 채널 (여기 455-465 nm의 525-535 ㎚)에 사용되는 각 염료의 피크 내에서 10 nm의 대역폭을 결정합니다. 파장 통해 규격화 강도를 플롯 및 수용체 채널 반대 (도 2)에 도너 염료의 크로스 토크 (cross-talk)의 평균 백분율을 계산한다.

(Y) 2. 준비 세포 배양 감염 enterocolitica 균주

1. 다음 균주를 사용 WA-314 PMK-난자가와 (WA-314 ¹⁷ PMK-즐와 PMK-OVA ^(17), 각각 플라스미드로 형질 전환) WA-314ΔYopE PMK-즐 (가 물에) ¹⁷ 314ΔYopE는 플라스미드로 형질 전환 된 PMK-즐
2. 감염 행진 Y. 전에 ​​적어도 이일 enterocolitica

결과

정량적 표적 세포 내로 이펙터 전위를 분석 한 방법의 성능을 입증하기 위해, 서로 다른 전위 속도론 두 르시 니아 균주가 연구되었다 : Y. 및 그 유도체 WA-314ΔYopE (pYVO8ΔYopE ²³ 숨겨 WA-314) (독성 플라스미드 pYVO8 ^(22)을 품고 혈청군 O8) enterocolitica 야생형 균주 WA-314. 이전 연구는 것을 보여 주었다 (Y) 기능 YopE 전시에게 상당히 높은 YOP 전위 율 ^(10)이 부족 enterocolitica 돌연변이. 두 균주 YopE 및 TEM-1 베타 - 락타 마제 (PMK-즐) ^(17)의 N 말단 분비 신호의 융합체를위한 벡터로 형질 전환 부호화 하였다. WA-314은 추가로 음성 대조군 역할을 각각 YopE의 난백 알부민 융합 (PMK-난자 ^17)에 대한 벡터 인코딩으로 변형되었다. 30.......

토론

우리는 여기에 성공적으로 Y로 이펙터 전위의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 - 락타 마제 기자 기반 분석을 적용 enterocolitica. 이 민감한 특정하고 비교적 간단한 기술의 많은 다른 변형이 문헌에 기재되어있다. 본 연구에서는 레이저 주사 현미경은 형광 신호의 가장 민감하고 정확한 검출을 수행 하였다. 특히 도너와 억 셉터 염료 및 개별적 조절 검출 대역폭 사이의 크로스 토크에 대한 보정 방법의 다른 변형에 비해 우수한 측정 정확도를 위해 허용한다. 결과는 분명히 방법은 정량적으로 전좌를 분석 할 수 있음을 보여준다. 세포 내 베타 - 락타 마제의 상이한 농도를 나타내는 다른 배양 시간은 긍정적 도너 형광 세기의 기울기와 상관 관계가 있었다. 또한 WA-314ΔYopE의 상당히 높은 전위 속도 비교야생형 균주 WA-314 입증 될 수있다.

데이터 분석을위한 두 가지 대안이 적용되었다 : 기증자 채널 강도와​​ 상대 무서워 계수를. 도.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LB-한천		로스 X969.2
LB-미디엄	로스	X968.2
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
96-웰 플레이트(검은색, 투명 바닥)	Greiner Bio One	655087
DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루베이트	Gibco/Life Technologies	31966-047
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G 로딩 키트(CCF4-AM	Life Technologies 포함)	K1095
Lectin은 Triticum vulgaris (밀) FITC 접합체	Sigma-Aldrich	L4895	사용됩니다. 피크 방출 및 크로스토크 결정에 사용됩니다
V450 Rat 안티-마우스 CD8a	BD Bioscience	560469	피크 방출 및 크로스토크 결정에 사용됩니다
. Immersol W 이멀젼 오일	Zeiss	444969-0000-000	굴절률 = 1.3339 @ 23 ° C
TCS SP5 II 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Leica microsystems		2x GaAsP-Hybrid 검출기, 4채널 분광계, acusto 광학 빔 스플리터, 전동 XY 스테이지, 조정 가능한 핀홀, 대물렌즈 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405  NM 다이오드 레이저 50  mW
, Imaris 7.6 소프트웨어	Bitplane		플러그인 포함, ImarisXT 및 MeasurementPro
MatLab, 컴파일러 런타임	MathWorks
Prism 5	GraphPad 소프트웨어

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