在前列腺癌的临床组织中miRNA的表达分析
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
在前列腺癌（PCA）的临床管理的一个重要挑战是目前使用的生物标志物的疾病筛查，诊断，预后和治疗的不足所造成。近年来，微RNA（miRNA）已成为有前途的替代标志物前列腺癌的诊断和预后。然而，miRNA的有效生物标记前列腺癌的发展在很大程度上依赖于他们在临床组织中准确的检测。 miRNA的分析了前列腺癌的临床标本往往是具有挑战性的，由于肿瘤的异质性，抽样误差，间质污染等。这篇文章的目的是描述一个简化的工作流程在存档FFPE和新鲜冷冻前列腺癌的临床标本的miRNA分析使用的组合定量实时PCR（RT-PCR），原位杂交（ISH）。在这个流程中，我们优化了miRNA的提取从FFPE现有的方法和冷冻前列腺Tissu酒店ES和表达分析了基于miRNA的RT-PCR的Taqman探针。此外，我们描述了ISH优化方法分析了使用锁核酸（LNA），前列腺组织formiRNA探测 – 基于探针。我们已优化的miRNA ISH方法可应用于前列腺癌组织切片或前列腺癌组织微阵列（TMA）。
Introduction
前列腺癌是一种常见的诊断男性恶性肿瘤即癌症相关死亡的男子居于领先地位的原因之一。在美国，估计有220800例新病例和27540例死亡将在2015年1报告。
前列腺癌是一种异质性疾病与高度可变的疾病课程 – 肿瘤可好逸恶劳或非常积极。在前列腺癌的临床管理的一个重要挑战是目前常用的方法/生物标志物的疾病筛查，诊断，预后和治疗2的不足所造成。当前的筛选方法包括前列腺特异性抗原（PSA）测试和直肠指检（DRE），随后前列腺活检3。前列腺特异性抗原（PSA）是使用最广泛的前列腺癌生物标志物已显著革命性临床管理和改进的存活率4。然而，由于粘合剂包括紫胶固有的局限性k的特异性，PSA为基础的筛选，导致过度的诊断和治疗上的疾病。鉴于此，积极努力正在指向一个搜索备用前列腺癌生物标志物，特别是那些可以预测疾病的攻击性和实现更好的治疗决策4,5。在过去的几年里，微RNA（miRNA）已成为有前途的替代前列腺癌生物标志物。
微RNA（miRNA）构成一个进化上保守类小的非编码RNA，它通过与同源的mRNA靶的3'-非翻译区（UTR）序列特异性相互作用的基因表达抑制转录后。据估计，>的mRNA的60％是保守的miRNA 6的目标。 miRNA基因位于基因间隔区或内含子或蛋白/非蛋白质的外显子编码基因7内。这些基因被RNA聚合酶Ⅱ优先转录成初步RY的miRNA（PRI-miRNA的，几千个碱基长）的形式发夹状茎环二级结构。这些PRI-miRNA的加工成miRNA前体（的pre-miRNA，60-75核苷酸长），其出口到细胞质和进一步加工成成熟miRNA（18-25核苷酸长）8-10。的miRNA调节关键的细胞过程，包括增殖，发育，分化和凋亡11。研究表明miRNA的表达谱在各种人类恶性肿瘤包括前列腺癌12-15普遍失调。 miRNA的表达谱已报道被广泛失调在原发性和转移性前列腺癌。改变的miRNA表达已与前列腺癌的进展，攻击性和复发突出的miRNA 12,14,16-19的预后潜力。越来越多的证据体表明miRNA的前列腺癌症的发生，发展，进步起到重要的作用机理离子和转移。总体而言，微RNA正在成为有前途的替代生物标志物前列腺癌的诊断和预后，可在前列腺肿瘤12分层正常，癌组织和援助加以区分。此外，miRNA是发展的有效的治疗方法预防前列腺癌20的重要目标。
由于它们的小尺寸和抗内源性RNase活性，miRNA是，可以在福尔马林固定的组织21和前列腺活检22容易地检测的生物标志物的稳定。此外，miRNA的表达谱进行了比较在冷冻和福尔马林固定的组织，并已被发现是强烈相关21。然而，miRNA表达谱的前列腺癌临床组织往往是具有挑战性的，由于肿瘤的异质性，抽样误差，间质污染等miRNA的有效生物标记物的前列腺癌严重RELI的发展ES它们在临床组织中精确检测。在这里，我们描述了在我们的实验室进行miRNA表达谱的存档FFPE和新鲜冷冻前列腺癌的临床标本使用简化的工作流程。我们使用定量实时PCR的组合和在对miRNA的原位杂交分析临床标本的，前者得到更多量化信息，后者用于可视化潜在的miRNA标志物的差异表达的组织中的阵列。在这个工作流程中，我们优化的miRNA提取从FFPE和冷冻前列腺组织的现有方法，表达由基于miRNA的RT-PCR和miRNA的原位杂交技术利用锁核酸（LNA）的Taqman探针分析为基础的探针23。 LNA基于探头提供增加的灵敏度和特异性相比DNA-或RNA-基于探针和使所有miRNA序列的鲁棒检测，无论其GC含量也允许discrimina化miRNA家族的。我们已优化的miRNA ISH方法可应用于前列腺癌组织切片或前列腺癌组织微阵列（TMA），后者提供到加速miRNA的生物标志物发现的潜力。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这篇文章中，我们描述了miRNA表达一个简化的工作流程分析在存档FFPE和新鲜冷冻前列腺癌的临床组织。在前列腺癌，一些研究表明，在前列腺癌的发生，发展和转移的microRNA中起重要作用。然而，矛盾的结果往往是获得一个特定的miRNA 22以来的miRNA的提取和分析方法有很大的出入。鉴于越来越多的证据支持的miRNA作为替代的前列腺癌生物标志物的前列腺癌的预后，诊断和治疗的潜在的应用…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢罗杰·埃里克森博士对他的支持和帮助准备手稿。
这项工作是由美国国家癌症研究所美国国立卫生研究院的支持
（批准号RO1CA177984; RO1CA138642），对前列腺癌（BX001604）VA计划项目。
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
