miRNA Expression Analyser i Prostata Cancer Kliniske Væv
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
En kritisk udfordring i prostatacancer (PSA) klinisk ledelse udgøres af den utilstrækkelige i øjeblikket anvendes biomarkører for sygdomme screening, diagnose, prognose og behandling. I de senere år har microRNA (miRNA) vist sig at være lovende alternative biomarkører for prostatakræft diagnose og prognose. Men udviklingen af miRNA som effektive biomarkører for prostatakræft er stærkt afhængig af deres nøjagtig påvisning i kliniske væv. miRNA analyser i prostatakræft kliniske prøver er ofte en udfordring på grund af tumor heterogenitet, stikprøvefejl, stromale forurening mv Målet med denne artikel er at beskrive en forenklet arbejdsgang for miRNA analyser arkiveret FFPE eller friske frosne prostatakræft kliniske prøver ved hjælp af en kombination af kvantitativ realtids-PCR (RT-PCR) og in situ-hybridisering (ISH). Inden for denne arbejdsproces, vi optimerer de eksisterende metoder til miRNA ekstraktion fra FFPE og frosne prostata tissues og ekspression analyser af Taqman-probe baseret miRNA RT-PCR. Desuden beskriver vi en optimeret fremgangsmåde til ISH analyser formiRNA detektion i prostatavæv under anvendelse låst nukleinsyre (LNA) – baserede prober. Vores optimerede miRNA ISH protokol kan anvendes til prostatakræft væv dias eller prostatakræft væv microarrays (TMA).
Introduction
Kræft i prostata er en almindeligt diagnosticeret mandlig malignitet, som er en af de førende årsager til kræft dødelighed blandt mænd. I USA, en anslået 220,800 nye tilfælde og 27,540 dødsfald vil blive rapporteret i 2015 1.
Prostatakræft er en heterogen sygdom med meget varierende sygdom kursus tumorer kan være ugidelig eller meget aggressiv. En kritisk udfordring i prostatakræft klinisk ledelse udgøres af den utilstrækkelige i øjeblikket anvendes metoder / biomarkører for sygdomme screening, diagnose, prognose og behandling 2. Aktuelle screeningsmetoder omfatter prostataspecifikt antigen (PSA) test og en digital rektal undersøgelse (DRE) efterfulgt af prostata biopsier 3. Prostataspecifikt antigen (PSA) er den mest udbredte prostatacancer biomarkør, der væsentligt revolutioneret kliniske behandling og forbedrede overlevelsesrater 4. Men på grund af iboende begrænsninger af PSA herunder lack af specificitet, PSA-baserede screening har ført til over diagnose og over behandling af sygdommen. I lyset af dette, er intensiv indsats er rettet mod en søgning efter alternative prostatakræft biomarkører, især dem, der kan forudsige aggressivitet af sygdommen og køre bedre beslutninger behandling 4,5. I løbet af de sidste par år, har microRNA (miRNA) dukket op som lovende alternative prostatakræft biomarkører.
MikroRNA'er (miRNA) udgør en evolutionært bevaret klasse af små ikke-kodende RNA, der undertrykker genekspression post-transkriptionelt via sekvensspecifikke interaktioner med 3'- utranslaterede regioner (UTR'er) af beslægtede mRNA mål. Det anslås, at> 60% af mRNA'er er bevaret mål for miRNA 6. miRNA gener er placeret i intergeniske regioner eller inden for introns eller exoner af protein / ikke-protein kodende gener 7. Disse gener er fortrinsvis transskriberes med RNA-polymerase II i primary miRNA (PRI-miRNA, flere kilobaser lang), som danner hårnål formet stilk loop sekundære strukturer. Disse pri-miRNA forarbejdes til precursor miRNA (præ-miRNA, 60-75 nukleotid lang), der eksporteres til cytoplasmaet og yderligere forarbejdede til modne miRNA (18-25 nukleotid lange) 8-10. miRNA regulerer vigtige cellulære processer, herunder proliferation, udvikling, differentiering og apoptose 11. Undersøgelser tyder på en udbredt dysregulering af miRNA udtryk profiler i forskellige menneskelige maligniteter, herunder prostatakræft 12-15. miRNA ekspressionsprofiler er blevet rapporteret til at være almindeligt dysreguleret i primær og metastatisk prostatacancer. Altered miRNA udtryk har været forbundet med prostatakræft progression, aggressivitet og gentagelse fremhæve den prognostiske potentiale miRNA 12,14,16-19. En voksende mængde beviser tyder på, at miRNA spiller vigtige mekanistiske roller i prostatakræft initiering, udvikling, fremskridtion og metastase. Samlet set er miRNA fremstår som lovende alternative biomarkører for prostatakræft diagnose og prognose, der kan skelne mellem normale og cancer væv og støtte lagdeling af prostata tumorer 12. Også miRNA er vigtige mål for udvikling af effektive lægemidler mod prostatakræft 20.
På grund af deres lille størrelse og modstandsdygtighed over for endogen RNase-aktivitet, miRNA er stabile biomarkører, som let kan påvises i formalin-fikserede væv 21 og prostata biopsier 22. Desuden har udtrykket profiler af miRNA blevet sammenlignet i frosne og formalinfikserede væv og har vist sig at være stærkt korreleret 21. Dog er miRNA udtryk profilering i prostatakræft kliniske væv ofte udfordrende på grund af tumor heterogenitet, stikprøvefejl, stromale forurening mv Udviklingen af miRNA som effektive biomarkører for prostatakræft stærkt relies på deres nøjagtig påvisning i kliniske væv. Her beskriver vi en forenklet arbejdsgang bruges i vores laboratorium for miRNA-ekspression profilering i arkiveret FFPE eller friske frosne prostatakræft kliniske prøver. Vi beskæftiger en kombination af kvantitativ real-time PCR og in situ hybridisering til miRNA analyser af kliniske prøver, med den tidligere giver flere kvantitative oplysninger og sidstnævnte til at visualisere forskellen udtryk for potentielle miRNA-biomarkører i en vifte af væv. Inden for denne arbejdsproces, vi optimerer de eksisterende metoder til miRNA ekstraktion fra FFPE og frosne prostata væv, udtryk analyser af Taqman-sonde baserede miRNA RT-PCR og miRNA in situ hybridisering teknik ved hjælp låst nukleinsyre (LNA) -baseret sonder 23. LNA-baserede sonder tilbyder øget sensitivitet og specificitet i forhold til DNA- eller RNA- baserede sonder og muliggør robust detektion af alle miRNA-sekvenser, uanset deres indhold GC og også tillade diskriminationtion af miRNA familier. Vores optimerede miRNA ISH protokol kan anvendes til prostatakræft væv dias eller prostatakræft væv microarrays (TMA), idet sidstnævnte giver mulighed for hurtigere at miRNA biomarkører.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel beskriver vi en forenklet arbejdsgang for miRNA-ekspression profilering i arkiveret FFPE eller friske frosne prostatakræft kliniske væv. I prostatakræft flere undersøgelser, tyder en vigtig rolle microRNA i prostatakræft initiering, progression og metastaser. Dog modstridende resultater ofte opnås på en bestemt miRNA 22 da miRNA udvinding og analyserer metoder er meget forskellige. I betragtning af den spirende dokumentation for den potentielle anvendelse af miRNA som alternative prosta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Roger Erickson for hans støtte og bistand med udarbejdelse af manuskriptet.
Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute på National Institutes of Health
(Grant Nummer RO1CA177984, RO1CA138642), VA-programmet projekt om prostatakræft (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
